質(zhì)譜分析具有靈敏度高、樣品用量少、分析速度快、分離和鑒定同時進行等優(yōu)點。隨著質(zhì)譜定量檢測技術的廣泛發(fā)展，穩(wěn)定同位素類化合物作為內(nèi)標定量 (Stable Isotope-Labeled Internal Standard，簡稱 SIL-IS) 目前已被公認為是質(zhì)譜定量分析領域的極佳選擇。因為穩(wěn)定同位素類化合物與被分析物具有幾乎完全相同的分子結(jié)構(gòu) (圖 1)、化學性質(zhì)、色譜和質(zhì)譜行為，可以有效地消除電離變化和基質(zhì)效應^[1]，因而受到越來越多科研人員的推崇，廣泛用于臨床醫(yī)學研究及生物醫(yī)學、環(huán)境科學、食品檢測等領域。

 

 

穩(wěn)定同位素作內(nèi)標，可以減少基質(zhì)效應、減少實驗的人為誤差、提高檢測的準確度和精密度、同時檢測多個數(shù)據(jù)、提高實驗效率，好處多多。那么穩(wěn)定同位素作為內(nèi)標的關鍵量值指標有哪些，該如何挑選穩(wěn)定同位素內(nèi)標呢？干貨如下，拿走不謝~

 

 
 
 

1. 穩(wěn)定同位素作為內(nèi)標的關鍵量值指標

a. 同位素產(chǎn)品純度：一般 ≥ 98%。常指色譜純度，如 LCMS/MS，GCMS，HPLC 等，如果產(chǎn)品吸收或者 MS 較弱，也可以用 NMR 檢測等。

b. 同位素產(chǎn)品豐度 (Isotopic Enrichment)：一般 ≥ 98%。

c. 同位素產(chǎn)品有效期：同位素化合物內(nèi)標均在有效期內(nèi)使用。
 

2. 如何挑選穩(wěn)定同位素內(nèi)標

a. 除非實驗特殊需求下，一般不選擇有活潑氘 (²H) 取代的同位素產(chǎn)品作內(nèi)標 (如氨基、羧基、羥基上的氫被氘取代)，這些活潑氘極易被交換為氫。

b. 同位素標記的 ¹³C 和¹⁵N 化合物穩(wěn)定性較好，但是 ¹³C和¹⁵N 的價格相對較貴些。目前市場上含有氘 (²H) 的同位素產(chǎn)品因為價格相對便宜且數(shù)量相對較多，因此在滿足實驗要求的情況下，也可選擇氘代物作為內(nèi)標。

c. 選擇氘 (²H) 代化合物作為內(nèi)標時，一般選擇比非同位素產(chǎn)品分子量多 3 及以上的產(chǎn)品 [即含有氘原子個數(shù)為 3 個 (D3) 或者以上]。

   

在有機分析研究中，質(zhì)譜分析法比化學和光學分析法具有更加卓越的性能，而穩(wěn)定同位素作內(nèi)標成為了質(zhì)譜定量的金標準，下面就隨著小 M 來看下穩(wěn)定同位素內(nèi)標在質(zhì)譜定量分析中的實際應用吧~

 
一、糖尿病人視網(wǎng)膜病變治療研究中的應用

Candesartan 和 Irbesartan 已被證明能有效預防糖尿病視網(wǎng)膜病變造成的損傷。為了開發(fā)新型治療此疾病的滴眼劑配方，Tan A 等人利用 Candesartan-d4 & Irbesartan-d4 穩(wěn)定同位素做內(nèi)標，開發(fā)了一種新的 LC-MS/MS 方法，此方法可同時定量測定出兔眼組織中 Candesartan & Irbesartan 的含量，并對該方法的濃度范圍、準確度及精密度、基質(zhì)效應、樣品回收率等均做了驗證。該方法也已成功應用于家兔的體內(nèi)生物分布和藥代動力學研究^[2]。

 

圖 2. Candesartan 和 Candesartan-d4, Irbesartan 和 Irbesartan-d4 的化學結(jié)構(gòu)

 

圖 3. 穩(wěn)定同位素類化合物做內(nèi)標實驗流程圖

 

那么如何操作呢？實驗的具體過程如下：

 
 
 
 

(1) Candesartan & Irbesartan 標準液及其同位素內(nèi)標液制備

在乙腈/水 (80/20，V/V) 中配置 Candesartan & Irbesartan 的標準液和內(nèi)標液，標準液分配成 200 和 500 μg/mL，內(nèi)標液配置 500 μg/mL 備用，放置于 -20 ℃ 備用。
 

(2) 樣品前處理

稱量好的兔眼組織樣品在稀釋的兔血漿中以 1:19 的比例混合均勻，其勻漿上清液保存于 -80 ℃。取 200 μL 的兔組織勻漿上清液依次與 100 μL 內(nèi)標液溶于甲醇/水 (20:80，V/V) 和水混合。然后將混合物裝載到預處理的 HLB 柱中洗脫。洗脫后的純品用 200 μL 甲醇/水/甲酸 (70:29.75:0.25，V/V/V) 復溶。
 

(3) LC-MS/MS 分析樣本

將 (2) 中稀釋好的的樣品 20 μL 注入 C18 柱進行梯度分離，柱溫 25 ℃，流速 0.8 mL/min。Candesarta 和 Candesarta-d4 在 5.1 min 洗脫，Irbesartan 和  Irbesartan-d4 在 4.1 min 洗脫。MS 檢測采用正電噴霧電離 (ESI) 模式。
 

(4）數(shù)據(jù)分析

通過分析六批次 456 個兔組織樣本，用 Candesartan-d4 & Irbesartan-d4 做內(nèi)標，準確測定了兔組織樣本中在角膜、房水和玻璃體樣本中的精確含量，測定出 Candesartan 在角膜中含量為 1704.75 ng/g，在房水中的含量為 63.45 ng/g；Irbesartan 在角膜中的含量為 3546.30 ng/g，在玻璃體中的含量為 36.52 ng/g.
 

圖 4. Candesartan 在角膜和房水樣本中的

LC-MS/MS 色譜圖

 

通過分析六批次 456 個兔組織樣本，用 Candesartan-d4 & Irbesartan-d4 作內(nèi)標，準確測定了兔組織樣本中 (角膜、房水和玻璃體) 的精確含量，測定出 Candesartan 在角膜中含量為 1704.75 ng/g，在房水中的含量為 63.45 ng/g。
 
二、COVID-19 藥物治療研究中的應用
全球 COVID-19 爆發(fā)以來，對此疾病的藥物治療研究備受科研工作者的重視。據(jù)報道，Ibuprofen 可以有效緩解與 COVID-19 相關的癥狀。Ibuprofen 的療效及其不良反應與其在血液中的濃度密切相關，所以準確定量測定 Ibuprofen 在血液中的濃度至關重要。

 

圖 5. Ibuprofen 和 Ibuprofen-d3 的化學結(jié)構(gòu)

 

Changmao Wang 等人用穩(wěn)定的同位素標記 Ibuprofen-d3 做內(nèi)標簡單、高效、準確地定量測定人血漿中的 Ibuprofen 含量，該方法不但檢測時間短，且無基質(zhì)效應及個體間差異性的影響，已成功應用于 18 名健康中國志愿者口服 Ibuprofen 顆粒后的臨床藥代動力學研究，其結(jié)果證明了 Ibuprofen 可以改善 COVID-19 免疫反應并縮短患者的康復時間^[3]。

 

圖 6. Ibuprofen 及 Ibuprofen-d3 在血脂、

溶血和人血漿中的基質(zhì)效應表，

顯示 Ibuprofen-d3 作內(nèi)標基質(zhì)效應無影響

 

跟著 M 君已經(jīng)了解了這些穩(wěn)定同位素內(nèi)標在質(zhì)譜定量分析中的應用，您目前是否也想嘗試下穩(wěn)定同位素產(chǎn)品在實驗中的應用呢？下面就讓 M 君帶您瀏覽下 MCE 穩(wěn)定同位素類產(chǎn)品吧！

 

相關產(chǎn)品

Exatecan-d5 (mesylate) 是Exatecan mesylate 的氘代物。Exatecan Mesylate 是一種 DNA 拓撲異構(gòu)酶 I (topoisomerase I) 抑制劑。

Candesartan-d4 是 Candesartan 的氘代物，Candesartan 是血管緊張素 II 受體拮抗劑。

Irbesartan-d4 是 Irbesartan 的氘代物，Irbesartan 是 Ang II 型 1 (AT1) 受體拮抗劑。

(±)-Levomepromazine-d6 是 Methotrimeprazine 的氘代物，Methotrimeprazine 在多個神經(jīng)遞質(zhì)受體部位具有拮抗作用，包括多巴胺能、膽堿能、血清素和組胺受體。

Sofosbuvir-d6 是 Sofosbuvir (PSI-7977) 的氘代物，Sofosbuvir 是 HCV RNA 復制抑制劑。

Ercalcidiol-d3 是 Ercalcidiol 的氘代物。Ercalcidiol 是維生素 D2 的代謝產(chǎn)物。Ercalcidiol 可用作維生素 D 狀態(tài)的指標。

MCE 的所有產(chǎn)品僅用作科學研究或藥證申報，我們不為任何個人用途提供產(chǎn)品和服務
 

參考文獻

1. Ulvik A, Ueland PM, et al. Quantifying Precision Loss in Targeted Metabolomics Based on Mass Spectrometry and Nonmatching Internal Standards. Anal Chem. 2021 Jun 1; 93 (21):7616-7624.
 
2. Tan A, Fanaras JC, et al. Simultaneous quantification of candesartan and irbesartan in rabbit eye tissues by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Biomed Chromatogr. 2020 May; 34 (5): e4808.
 
 
3. Wang C, Jia Y, et al. Establishment and validation of an SIL-IS LC-MS/MS method for the determination of ibuprofen in human plasma and its pharmacokinetic study. Biomed Chromatogr. 2022 Mar; 36 (3): e5287.