淀粉樣蛋白沉積和致病標志物周圍細胞網絡失調的揭示
近日，Cell 在線發表的論文 “Spatial Transcriptomics and In Situ Sequencing to Study Alzheimer’s Disease” 中，研究團隊在 AD 小鼠模型中，利用空間轉錄組學研究淀粉樣斑塊周圍直徑 100 μm 的組織結構域的轉錄變化，證明了豐富的髓鞘和少突膠質細胞基因 (OLIGs) 的基因共表達網絡的早期改變，而斑塊誘導基因 (PIGs) 的多細胞基因共表達網絡涉及補體系統、氧化應激、溶酶體和炎癥，在疾病的后期表現突出。研究人員通過對小鼠和人腦切片的原位測序，證實了細胞水平上觀察到的大部分變化。全基因組空間轉錄組分析提供了一個新的方法，以揭示 AD (淀粉樣蛋白沉積) 和其他腦疾病的致病標志物周圍的細胞網絡失調。
研究背景
淀粉樣斑塊與神經變性過程的關系是 AD 研究中的一個核心問題。自從“淀粉樣蛋白沉積”的病理現象被發現后，一個世紀以來，科學界展開了大量的研究，直到現在這種現象與 AD 疾病發展之間的關系仍未明了。已知：
1、淀粉樣斑塊可能起 AD 的觸發或驅動作用。
2、散發性 AD 的風險與小膠質細胞中響應淀粉樣蛋白沉積的基因表達相關，星形膠質細胞、神經元和少突膠質細胞也表現出對淀粉樣斑塊的分子反應。
3、在 AD 中，將神經元、各種神經膠質細胞分離再檢測胞質 mRNA 結果并不理想，還可能人為的影響表達圖譜，導致大多數空間信息的丟失，包括細胞和淀粉樣斑塊的關系�？臻g條形碼陣列 (Spatially barcoded arrays) 支持進行組織中無偏倚的轉錄組分析，維持已測序分子的空間定位。
Bart De Strooper 和 Mark Fiers 研究團隊通過一種開創性技術來具體研究斑塊附近的腦細胞中發生的變化。
圖 1. 研究概要圖
文章概要
在小鼠和人腦樣本中，該研究結合空間轉錄組法和原位測序的實驗方法，顯示了 AD 中的多細胞基因共表達網絡。研究團隊鑒定了兩個由淀粉樣斑塊沉積誘導表達網絡，一個是斑塊誘導基因 (PIG) 網絡，主要涉及小膠質細胞和星形膠質細胞；另一個是少突膠質細胞基因 (OLIG) 和髓鞘反應。
主要研究方法
空間轉錄組方法 (ST)
正交原位測序方法 (ISS)
RNAscope 原位雜交技術
免疫熒光檢測技術
小鼠模型
AppNL-G-F小鼠 (AD 小鼠模型，App gene：淀粉樣前蛋白基因)
C57BL/6 小鼠研究結果
研究團隊對 AD 小鼠的 10,327 個組織域 (TD) 空間轉錄組 (ST) 圖譜根據大腦區域進行聚類，并通過 WGCNA (基因共表達網絡分析，基于具有相似表達模式的基因可能具有相似的功能) 劃分模塊。作者重點介紹了對 β-淀粉樣蛋白 (Aβ) 高度敏感的兩個 WGCNA 模塊：PIGs 和 OLIGs。
圖 2. Gene Ontology 分析和 WGCNA 分析
(purple: PIGs; red: OLIGs)
■ PIG 模塊
斑塊誘導基因 (Plaque-induced gene, PIG) 主要在星形膠質細胞和小膠質細胞中表達，體現了它們之間的細胞間串擾，并涉及其他細胞。這種相互作用使經典補體系統和內體/溶酶體途徑伴隨著改變。
為了了解基因表達的變化，研究人員進行了兩次差異表達分析。第一次比較 AppNL-G-F 小鼠與 C57BL/6 小鼠 (基因型模型，基因型軸)，第二個研究 Aβ 沉積對基因表達的影響 (Aβ 模型，Aβ 軸) 。
在 App 敲入的 AD 小鼠模型中，淀粉樣蛋白斑塊微環境中逐步建立一種多細胞共同表達的基因反應。其中包括 57 個 PIGs，在 Aβ 軸和基因型軸在晚期 (18 個月大小鼠) 反應最為活躍，這些基因在早期 (3 個月) 只是輕微上調，經歷一個急劇上升到晚期穩定的過程。因此，PIG 的表達隨著在整個腦區域中 Aβ 的積累而逐漸增加。
該模塊中涉及了經典補體級聯 (如 C1qa，C1qb，C1qc 等)，還有補體級聯所觸發的效應機制，如內吞作用 (如 Fcer1g，Fcgr3，B2m 等)，溶酶體降解 (如 Hexa，Hexb，Ctsa 等) ，抗原加工提呈、免疫應答和氧化還原過程。此外，PIG 模塊的細胞標志與激活的小膠質細胞和炎性星形膠質細胞有很高的重疊性。
圖 3. PIG 與 ARM/DAM
小膠質細胞和星形膠質細胞部分重疊
(DAM：疾病相關的小膠質細胞；
ARM：激活反應的小膠質細胞)
其他實驗補充：ST 結果顯示了淀粉樣斑塊周圍有多細胞反應，但 ST 技術無法達到單細胞水平，因此研究團隊還通過 ISS 在單細胞水平上作為對實驗進行補充，ISS 的結果與 ST 的結果具有很好的相關性。PIG 網絡的細胞標志顯示，PIG 對 Aβ 的反應在很大程度上是由小膠質細胞引起的，在較小程度上由星形膠質細胞引起的。利用 RNAscope 原位雜交驗證了補體組分 (C1qa，C4 和 Clu) 在晚期 AD 小鼠模型中的表達，這 3 個補體組分的細胞標志與 ISS 分析一致。
圖 4. 隨著 Aβ 沉積逐步建立的 PIGs 的共表達網絡
PIGs 中小膠質細胞和星型膠質細胞基因的共表達：根據 Aβ 沉積水平將所有 ST TD 分為 WT 和 AD 的四個等級，WGCNA 生成一個指示基因之間相關性的共表達通用矩陣，隨著 Aβ 積累的增加，基因聯系的“劑量”敏感性 (Dose-sensitive) 增加，顯示了表達網絡隨著 Aβ 暴露的增加而逐步建立。
■ OLIG 模塊
少突細胞基因 (oligodendrocyte gene, OLIG) 為髓鞘化相關基因，主要由少突膠質細胞表達。
WGCNA 第二個大的模塊由主要由少突膠質細胞表達的 165 個基因組成，被稱為 “OLIG 模塊”。實驗證明，OLIG 模塊在中度 Aβ 暴露時高表達，但是在重度 Aβ 暴露的微環境中下降。因此，OLIG 模塊表達的大腦區域差異與 Aβ 表達程度相關。
圖 5. OLIG 模塊對 Aβ 積累的響應
(Oli0：人類 AD 相關的少突膠質細胞標記物的小鼠直系同源物)
總的來說，該研究證實了 OLIGs 的基因共表達網絡在疾病早期改變，而 PIGs 的多細胞基因共表達網絡涉及補體系統、氧化應激、溶酶體和炎癥，在疾病的后期表現突出。
■ 人腦中 PIG 和 OLIG 模塊的可視化
研究人員對 AD 患者額上回組織樣本的 222 個基因表達譜進行分析，包括 PIGs 的 45 個人類同源序列表達，OLIG 模塊中 42 個斑塊反應性基因同源序列的表達，以及一系列的細胞類型標志，如預期一樣，PIG 模塊和 OLIG 模塊基因分別在灰質和白質中富集。使用同樣的 ISS 方法研究了 PIGs 在對照和 AD 腦中人類直系同源物的分布，證明了 AD 患者中與疾病相關的神經膠質活化。
圖 6. 人腦中 PIG 和 OLIG 模塊的分析
結論：
實驗技術：展示了最近開發的 ST 和 ISS 技術在腦疾病方面的應用。
實驗結果：數據表明，淀粉樣斑塊在疾病發展中“并非無辜”，實際上，它誘導了周圍所有細胞的強烈和協調的反應。因此，還需要進一步的工作來了解是否以及何時去除淀粉樣蛋白斑塊足以逆轉正在進行的細胞過程。另外，抗體結合淀粉樣斑塊將調節這些膠質反應有待確定，這會使臨床試驗的結果的解釋復雜化，因為細胞效應可能因抗體而異。
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縮寫：
AD：Alzheimer’s diseaseOLIGs ：Oligodendrocyte genes
PIGs：Plaque-induced genes
Aβ：Amyloid β-protein
ST ：Spatial transcriptomics
TDs ：Tissue domains
App：Amyloid precursor protein
ENTI：Entorhinal area
ISS ：In situ sequencing
DAM ：Disease-associated microglia
ARM：Activated response microglia
原文閱讀：Wei-Ting Chen, et al. Spatial Transcriptomics and In Situ Sequencing to Study Alzheimer's Disease. Cell. 2020 Jul 17;S0092-8674(20)30815-1.
