丙酮酸羧化酶（PC)試劑盒說明書微量法100管/96樣

注    意：正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定
測定意義：
丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase，PC，EC 6.4.1.1)廣泛存在于動物、霉菌和酵母的線粒體中，催化丙酮酸、ATP、CO₂和水生成草酰乙酸、ADP和Pi，是糖異生過程的第一個限速酶，在保證血糖的動態(tài)平衡方面起著重要的作用。
 
測定原理：
PC催化丙酮酸、ATP、CO₂和水生成草酰乙酸、ADP和Pi，蘋果酸脫氫酶進一步催化草酰乙酸和NADH生成蘋果酸和NAD⁺，在340nm下測定NADH氧化速率，即可反映PC活性。
 
需自備的儀器和用品：
分光光度計/酶標儀、臺式離心機、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。
 
試劑的組成和配制：
提取液：100mL×1瓶，4℃保存；
試劑一：液體18 mL×1瓶， 4℃保存；
試劑二：液體13uL×1支，4℃保存；
試劑三：粉劑×1支，-20℃保存；
試劑四：粉劑×1支，-20℃保存；
 
樣本的前處理：
組織、細菌或細胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：
1、 稱取約0.1g組織或收集500萬細菌或細胞，加入1mL提取液，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。
2、 將勻漿600g，4℃離心5min。
3、 棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心10min。
4、 上清液即胞漿提取物，可用于測定從線粒體泄漏的PC（此步可選做）。
5、 在步驟④的沉淀中加入1mL提取液，超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W，超聲3秒，間隔10秒，重復30次），用于線粒體PC活性測定。
 
測定步驟：

• 分光光度計或酶標儀預熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至340nm，蒸餾水調(diào)零。

工作液的配制：臨用前將試劑二和試劑三轉(zhuǎn)移到試劑一中混合溶解待用；置于37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)預熱5分鐘；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融。
試劑四的配制：在試劑四瓶中加入1mL蒸餾水充分溶解待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融。

• 在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本、10μL試劑四和180μL工作液，立即混勻，記錄340nm處初始吸光值A1和 2min后的吸光值A2，計算ΔA=A1-A2。
• 注意：在該試劑盒中，若ΔA大于0.5，需將樣本用提取液稀釋適當倍數(shù)后測定，使ΔA小于0.5可提高檢測靈敏度。計算公式中乘以相應稀釋倍數(shù)。
   
  PC活性計算：
  a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下
  （1）按樣本蛋白濃度計算
  單位定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個酶活力單位。
  PC（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=1608×ΔA÷Cpr
  （2）按樣本鮮重計算
  單位定義：每g組織每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。
  PC（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W ×V樣÷V樣總)÷T=1608×ΔA÷W
  （3）按細菌或細胞密度計算：
  單位定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。
  PC（nmol/min/10⁴ cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=3.215×ΔA
  V反總：反應體系總體積，2×10^-4 L；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.01 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應時間，2 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細菌或細胞總數(shù)，500萬。
   
  b.用96孔板測定的計算公式如下
  （1）按樣本蛋白濃度計算
  單位定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個酶活力單位。
  PC（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=3216×ΔA÷Cpr
  （2）按樣本鮮重計算
  單位定義：每g組織每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。
  PC（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W ×V樣÷V樣總)÷T=3216×ΔA÷W
  （3）按細菌或細胞密度計算：
  單位定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。
  PC（nmol/min/10⁴ cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=6.43×ΔA
  V反總：反應體系總體積，2×10^-4 L；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V樣：加入樣本體積，0.01 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應時間，2 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細菌或細胞總數(shù)，500萬。