RNA 逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)
Tips 1：防止 RNA 模板的降解
毫無疑問，RNA 質(zhì)量對(duì) cDNA 合成結(jié)果會(huì)產(chǎn)生重要影響。但 RNA 很脆弱，易于降解。為了保證 RNA 的完整性，我們需要小心又小心，比如在冰上操作，用 RNase-free 的槍頭和離心管，減少操作時(shí)間等。在反應(yīng)體系中加入 RNase 抑制劑也能有效防止 RNA 降解。另外，建議在進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄前，通過瓊脂糖凝膠電泳檢查 RNA 條帶的質(zhì)量。通常完整的真核 RNA 應(yīng)包括 28S、18S 條帶，且 28S 條帶強(qiáng)度一般是 18S 的兩倍左右。
Tips 2：RNA 定量
除了掌握 RNA 的完整性之外，反轉(zhuǎn)錄之前還需要對(duì) RNA 濃度進(jìn)行測(cè)定。一般反轉(zhuǎn)錄試劑盒會(huì)對(duì)上樣量有要求，建議 total RNA 上樣量小于 5 μg。超過這個(gè)范圍，會(huì)使反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物產(chǎn)生偏好性 (表達(dá)豐度高的基因優(yōu)先被反轉(zhuǎn)錄) 而造成定量結(jié)果不準(zhǔn)確。
Tips 3：去除基因組 DNA 污染
殘留的基因組 DNA (gDNA) 會(huì)對(duì)熒光定量結(jié)果造成很大的干擾，為了使結(jié)果更加的真實(shí)、可重復(fù)，我們需要去除 gDNA 干擾。我們可以在引物設(shè)計(jì)時(shí)避免 gDNA 的擴(kuò)增，比如將上下游引物分別設(shè)在不同的外顯子上；或者在提取 RNA 后使用 DNase I 處理以除去 gDNA。最后，我們還有終極法寶——選擇一款具有 gDNA 去除功能的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，一步到位去除 gDNA，省心省力 max。
Tips 4：選擇合適的引物
Oligo dT 引物和隨機(jī)引物都能進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。Oligo dT 引物只能與 mRNA 的 3’ 端 poly (A) 結(jié)合，沒有 rRNA 和 tRNA 的干擾，特異性強(qiáng)。但其對(duì) RNA 的完整度和二級(jí)結(jié)構(gòu)的要求較高，而且不適用于原核生物。隨機(jī)引物可以根據(jù)堿基情況結(jié)合到幾乎所有的 RNA 上，包括 mRNA、tRNA 和 rRNA。但隨機(jī)引物法逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的片段較小，很難得到全長轉(zhuǎn)錄本的 cDNA。
單獨(dú)選擇某一種引物，實(shí)驗(yàn)可能都不完美，具體需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康膩泶_定。當(dāng)然我們還可以選擇全都要！MCE RT mix 含有比例優(yōu)化的 Oligo (dT) 和 Random Primers，使 cDNA 合成可從 RNA 轉(zhuǎn)錄本的各個(gè)區(qū)域起始，并具有相同的逆轉(zhuǎn)錄效率，最大程度保證 qPCR 結(jié)果的真實(shí)性和可重復(fù)性。
圖 2. Oligo dT 引物和隨機(jī)引物
Tips 5：逆轉(zhuǎn)錄酶熱穩(wěn)定性
逆轉(zhuǎn)錄酶在整個(gè)反轉(zhuǎn)錄體系中具有關(guān)鍵性影響。除了活性以外，逆轉(zhuǎn)錄酶的熱穩(wěn)定性同樣很重要，在較高溫度下進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，能夠減少 RNA 的二級(jí)結(jié)構(gòu)，增加逆轉(zhuǎn)錄的效率。野生型的 M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶很“怕熱”，高于 37℃ 時(shí)，穩(wěn)定性大幅下降。MCE 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒全面升級(jí)
采用熱穩(wěn)定性大幅度提高的第三代逆轉(zhuǎn)錄酶，該酶可耐受高達(dá) 60℃ 的反應(yīng)溫度，適合具有復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)的 RNA 模板的逆轉(zhuǎn)錄。
1、逆轉(zhuǎn)錄溫度 55℃，攻克復(fù)雜模板及高 GC 模板；
2、逆轉(zhuǎn)錄時(shí)間縮短至 15 min，高效逆轉(zhuǎn)錄；
3、合并 gDNA digester 與 gDNA digester buffer，使用更方便；
4、與模板的親和力增強(qiáng)，少量模板及低拷貝基因的逆轉(zhuǎn)錄同樣適用。
圖 3. 高 GC 基因表達(dá)量測(cè)定。模板 293T 細(xì)胞，RNA 投入 300 ng，反應(yīng)體系 20 μL 55℃ 反應(yīng)不同時(shí)間
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