• 三維構象：BP26 蛋白是牛布魯氏菌外膜的主要脂蛋白，屬于外膜蛋白（OMP）家族，其結構特征如下： 
  • N 端信號肽：前 20-25 個氨基酸為脂蛋白信號肽（含保守的脂錨定位點 Cys），經翻譯后修飾連接脂質分子，錨定于細菌外膜。
  • 核心結構域：由 180-200 個氨基酸組成，形成 β- 桶狀跨膜結構（含 8-10 個 β- 折疊），桶狀結構內側親水性氨基酸與周質空間互作，外側疏水性氨基酸嵌入外膜脂質雙層。
  • 表面暴露環：包含多個抗原性環區（如 Loop 3、Loop 5），暴露于細菌表面，是宿主免疫識別的主要區域。

• 原核表達結構：重組表達時通常去除 N 端信號肽，僅保留成熟肽段（約 180 個氨基酸），以可溶性形式表達，其 β- 桶結構可通過圓二色譜（CD）驗證，β- 折疊含量約 45%-50%。

• 天然 BP26 蛋白：成熟肽段分子量約 26 kDa（因此得名 BP26），加上脂質修飾后實際分子量約 28-30 kDa，SDS-PAGE 中遷移率略慢于理論值。
• 重組 BP26 蛋白：去除信號肽后理論分子量約 22-24 kDa（因不同菌株序列差異略有波動），無糖基化修飾，純化后 SDS-PAGE 顯示單一 24 kDa 條帶（與天然蛋白脂質修飾前分子量一致）。

• 種屬特異性抗原：BP26 蛋白在牛布魯氏菌中高度保守，與羊布魯氏菌（B. melitensis）、豬布魯氏菌（B. suis）的同源蛋白有 60%-70% 序列相似性，可作為牛布魯氏菌的血清學診斷標志物。
• 免疫反應靶點：感染牛后，宿主產生的抗 BP26 抗體主要為 IgG，可通過 ELISA 或免疫印跡（WB）檢測，用于布魯氏菌病的輔助診斷。

• 熱穩定性：BP26 蛋白的 β- 桶結構使其具有較強的熱穩定性，60℃處理 30 分鐘仍保留部分抗原活性，但 100℃煮沸會導致結構不可逆破壞。
• 外膜錨定功能：脂質修飾的 N 端 Cys 殘基與外膜磷脂共價結合，維持細菌外膜完整性，參與布魯氏菌逃避免疫清除的機制（如抑制吞噬體 - 溶酶體融合）。

• BP26 蛋白表面抗原環區可發生抗原變異（如氨基酸突變或糖基化修飾），降低宿主抗體識別效率，是布魯氏菌慢性感染的致病機制之一。

根據重組 BP26 蛋白的表達系統及形式，常用純化方法如下：

• 表達形式：可溶性表達于細胞質或周質空間，少數情況下形成包涵體（需優化誘導條件）。
• 純化流程： 
  • 破菌與分離：超聲破碎細菌，離心收集上清液（可溶性蛋白），周質空間蛋白可通過滲透壓休克法釋放。
  • 親和層析（首選）： 
    • 融合 His-tag 時，使用 Ni-NTA 柱純化：平衡液（20 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 10 mM 咪唑，pH 7.4）洗滌，250 mM 咪唑洗脫，純度可達 85%-90%。
    • 融合 GST-tag 時，用谷胱甘肽瓊脂糖樹脂純化，10 mM 還原型谷胱甘肽洗脫。
  • 凝膠過濾層析（精純）：通過 Superdex 75 柱去除聚合體或雜蛋白，進一步提高純度至 95% 以上，同時驗證蛋白單體狀態（洗脫峰對應 24 kDa 分子量）。
  • 脫鹽與保存：透析至 PBS（pH 7.4），添加 50% 甘油（-20℃凍存）或 0.1% BSA（4℃短期保存），防止蛋白聚集。

• 分泌型表達優勢：畢赤酵母或桿狀病毒 - 昆蟲細胞可實現 BP26 蛋白的分泌表達，避免原核表達的內毒素污染，適合制備診斷用高純度抗原。
• 純化步驟：培養上清經離心、0.22 μm 濾膜過濾后，直接通過親和層析（同原核）或離子交換層析（利用 pI 約 8.0 的正電荷特性，通過 SP Sepharose 柱純化）。

• 若表達條件不佳導致包涵體形成，需用 6-8M 尿素溶解，Ni-NTA 柱純化后，通過梯度透析復性（添加 10 mM DTT 防止二硫鍵錯誤折疊），復性效率約 50%-60%，復性后需通過 ELISA 驗證抗原活性。

• SDS-PAGE 與 WB 驗證：純化后的 BP26 蛋白在 24 kDa 處顯影，且可與牛布魯氏菌陽性血清特異性結合（WB 條帶清晰）。
• ELISA 應用：包被重組 BP26 蛋白（1-5 μg/mL）可檢測牛血清中的抗布魯氏菌抗體，與商業試劑盒（如 iELISA）的符合率達 90% 以上，適用于布魯氏菌病的現場篩查。
• 疫苗研究：BP26 蛋白與佐劑（如 Montanide）聯合免疫小鼠，可誘導產生 IFN-γ 和 IL-4，提示其兼具 Th1 和 Th2 型免疫應答，是亞單位疫苗的候選抗原之一。

牛布魯氏菌 BP26 蛋白作為外膜脂蛋白，其保守的 β- 桶結構和種屬特異性抗原性使其成為布魯氏菌病診斷與疫苗研發的關鍵靶點。原核表達系統（大腸桿菌）因低成本和高表達量成為首選，配合親和層析和凝膠過濾可獲得高純度蛋白；真核系統（如酵母、昆蟲細胞）則可更好地模擬天然脂質修飾，適用于結構與免疫機制研究。純化后的 BP26 蛋白在血清學診斷（如 ELISA 試劑盒）和亞單位疫苗開發中具有重要應用價值，為牛布魯氏菌病的防控提供了有效工具。