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聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)體系各組份分述

瀏覽次數(shù):205 發(fā)布日期:2025-7-10  來源:本站 僅供參考,謝絕轉(zhuǎn)載,否則責任自負

聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)是在體外進行的由引物介導(dǎo)的酶促DNA擴增反應(yīng)。PCR的原理是在模板DNA、PCR引物、四種脫氧核糖核苷酸(dNTP)及適當濃度的Mg2+存在的條件下,依賴于DNA聚合酶的體外酶促合成反應(yīng)。兩個引物分別位于靶序列兩端,同兩條模板的3’端互補,由此限定擴增片段。PCR反應(yīng)由一系列的變性→退火→延伸反復(fù)循環(huán)構(gòu)成,即在高溫下模板雙鏈DNA變性解鏈,然后在較低溫度下同過量引物退火,再在適中溫度下由DNA聚合酶催化進行延伸。理論上,經(jīng)過N次循環(huán)可使特定片段擴增到2n-1,考慮到擴增效率達不到100%,所以通常經(jīng)25到30次循環(huán)可擴增到106倍,足夠后續(xù)實驗展開。

PCR反應(yīng)體系由反應(yīng)緩沖液(PCR Buffer)、脫氧核苷三磷酸底物(dNTP mix)、Taq DNA聚合酶(Taq 酶)、寡聚核苷酸引物(Primer1,Primer2)、 Mg2+、靶序列(DNA模板)主要成份組成。各個組份對PCR結(jié)果至關(guān)重要。
 


1、 反應(yīng)緩沖液(PCR Buffer)

(1)、反應(yīng)緩沖液一般含10-50 mmol/L Tris·Cl (20℃下pH8.3-8.8), 50 mmol/L KCl和適當濃度的Mg2+ 。Tris·Cl在20℃時pH為8.3-8.8,但在實際PCR反應(yīng)中,pH為6.8-7.8. 50 mmol/L的KCl有利于引物的退火。
(2)、反應(yīng)液可加入5mmol/L的二硫蘇糖醇(DDT)或100 μg/ml的牛血清白蛋白(BSA),它們可穩(wěn)定酶活性,另外加入T4噬菌體的基因32蛋白則對擴增較長的DNA片段有利。
(3)、各種Taq DNA聚合酶商品都有自己特定的一些緩沖液。

2、 脫氧核苷三磷酸底物(dNTP mix)

dNTP包括dATP、dTTP、dGTP、dCTP。dNTP的質(zhì)量與濃度和PCR擴增效率有密切關(guān)系,dNTP粉呈顆粒狀,如保存不當易變性失去生物學活性。多次凍融會使dNTP降解。dNTP能與Mg2+結(jié)合,使游離的Mg2+濃度降低。當PCR需要較高濃度的dNTP時,應(yīng)在反應(yīng)體系中適當增加Mg2+的濃度。

(1)dNTP應(yīng)用NaOH 將pH調(diào)至7.0,并用分光光度計測定其準確濃度。
(2)dNTP原液可配成5-10 mmol/L并分裝,-20℃貯存。一般反應(yīng)中每種dNTP的終濃度為20-200 μmol/L。
(3)理論上4 種 dNTP各20 μmol/L,足以在100 μl反應(yīng)中合成2.6 μg的DNA。當dNTP終濃度大于50 mmol/L時可抑制Taq DNA聚合酶的活性。4種dNTP的濃度應(yīng)該相等,以減少合成中由于某種dNTP的不足出現(xiàn)的錯誤摻入。
                                                               
3、 Taq DNA聚合酶(Taq 酶)

一般Taq DNA聚合酶活性半衰期為92.5℃ 130 min,95℃ 40 min, 97℃ 5 min。現(xiàn)在人們又發(fā)現(xiàn)許多新的耐熱的DNA聚合酶,這些酶的活性在高溫下活性可維持更長時間。

Taq DNA聚合酶的酶活性單位定義為74℃下,30 min,摻入10 nmol/L dNTP到核酸中所需的酶量。Taq DNA聚合酶的一個致命弱點是它的出錯率,一般PCR中出錯率為2×10-4 核苷酸/每輪循環(huán),在利用PCR克隆和進行序列分析時尤應(yīng)注意.在100 μl PCR反應(yīng)中,1.5-2單位的Taq DNA聚合酶就足以進行30輪循環(huán)。

所用的酶量可根據(jù)DNA、引物及其它因素的變化進行適當?shù)脑鰷p.酶量過多會使產(chǎn)物非特異性增加,過少則使產(chǎn)量降低。

反應(yīng)結(jié)束后,如果需要利用這些產(chǎn)物進行下一步實驗,需要預(yù)先滅活Taq DNA聚合酶, 滅活Taq DNA聚合酶的方法有:
(1)PCR產(chǎn)物經(jīng)酚: 抽提,乙醇沉淀。
(2)加入10 mmol/L的EDTA螯合Mg2+ 。
(3) 99-100℃加熱10 min。目前已有直接純化PCR產(chǎn)物的Kit可用。

4、 寡聚核苷酸引物

PCR反應(yīng)產(chǎn)物的特異性由一對上下游引物所決定。引物的好壞往往是PCR成敗的關(guān)鍵。引物設(shè)計和選擇目的DNA序列區(qū)域時可遵循下列原則:
(1) 引物長度約為16-30 bp, 太短會降低退火溫度影響引物與模板配對,從而使非特異性增高。太長則比較浪費,且難以合成。
(2)引物中G+C含量通常為40%-60%,可按下式粗略估計引物的解鏈溫度 Tm=4(G+C)+2(A+T)。
(3)四種堿基應(yīng)隨機分布,在3'端不存在連續(xù)3個G或C,因這樣易導(dǎo)致錯誤引發(fā)。
(4)引物3'端最好與目的序列閱讀框架中密碼子第一或第二位核苷酸對應(yīng), 以減少由于密碼子擺動產(chǎn)生的不配對。
(5)在引物內(nèi), 尤其在3'端應(yīng)不存在二級結(jié)構(gòu)。
(6)兩引物之間尤其在3'端不能互補, 以防出現(xiàn)引物二聚體, 減少產(chǎn)量。兩引物間最好不存在4個連續(xù)堿基的同源性或互補性。
(7)引物5'端對擴增特異性影響不大, 可在引物設(shè)計時加上限制酶位點、核糖 體結(jié)合位點、起始密碼子、缺失或插入突變位點以及標記生物素、熒光素等。通常應(yīng)在5'端限制酶位點外再加1-2個保護堿基。
(8)引物不與模板結(jié)合位點以外的序列互補。所擴增產(chǎn)物本身無穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu), 以免產(chǎn)生非特異性擴增,影響產(chǎn)量。
(9)簡并引物應(yīng)選用簡并程度低的密碼子, 例如選用只有一種密碼子的Met, 3'端應(yīng)不存在簡并性。否則可能由于產(chǎn)量低而看不見擴增產(chǎn)物。
(10)一般PCR反應(yīng)中的引物終濃度為0.2-1.0 μmol/L。引物過多會產(chǎn)生錯誤引導(dǎo)或產(chǎn)生引物二聚體, 過低則降低產(chǎn)量。利用紫外分光光度計, 可精確計算引物濃度, 在1cm光程比色杯中,260nm下,引物濃度可按下式計算:
X mol/L= OD260/ A(16000)+C(70000)+G(12000)+T(9600)
X: 引物摩爾濃度,A、C、G、T:引物中4種不同堿基個數(shù)。

5、 Mg2+

(1)Mg2+濃度對Taq DNA聚合酶影響很大,它可影響酶的活性和真實性,影響引物退火和解鏈溫度, 影響產(chǎn)物的特異性以及引物二聚體的形成等。
(2)通常Mg2+ 濃度范圍為0.5-2 mmol/L.對于一種新的PCR反應(yīng),可以用0.1-5 mmol/L的遞增濃度的Mg2+ 進行預(yù)備實驗,選出最適的Mg2+濃度。
(3)在PCR反應(yīng)混合物中, 應(yīng)盡量減少有高濃度的帶負電荷的基團, 例如磷酸基團或EDTA等可能影響Mg2+ 離子濃度的物質(zhì),以保證最適Mg2+ 濃度。

6、 靶序列(DNA模板)

(1)PCR反應(yīng)必須以DNA為模板進行擴增, 模板DNA可以是單鏈分子,也可以是雙鏈分子,可以是線狀分子,也可以是環(huán)狀分子(線狀分子比環(huán)狀分子的擴增效果稍好)。
(2)就模板DNA而言,影響PCR的主要因素是模板的數(shù)量和純度.一般反應(yīng)中的模板數(shù)量為102 -105 個拷貝,對于單拷貝基因,這需要0.1μg的人基因組DNA,10ng的酵母DNA,1ng的大腸桿菌DNA.擴增多拷貝序列時,用量更少。
(3)靈敏的PCR可從一個細胞,一根頭發(fā),一個孢子或一個精子提取的DNA中分析目的序列。
(4)模板量過多則可能增加非特異性產(chǎn)物。DNA中的雜質(zhì)也會影響PCR的效率。

注意事項:

1.PCR應(yīng)該在沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進行,最好設(shè)立一個專用的PCR配制室、模板室、擴增室,避免污染(16S)。
2.純化模板所選用的方法對污染的風險有極大影響。一般而言,只要能夠得到可靠的結(jié)果,純化的方法越簡單越好。
3.所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染,操作過程中均應(yīng)戴手套。
4.PCR試劑配制應(yīng)使用最高質(zhì)量的新鮮雙蒸水,采用0.22μm濾膜過濾除菌或高溫高壓滅菌。5.試劑都應(yīng)該以大體積配制,然后分裝成僅夠一次使用的量儲存,從而確保實驗與實驗之間的連續(xù)性與平行性。
6.試劑或樣品準備過程中都要使用滅菌的tubes和tips,玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。
7.PCR配制試劑應(yīng)在冰上融化,并且要瞬離并充分混勻。

發(fā)布者:上海撫生實業(yè)有限公司
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