UP.SIGHT2.0實(shí)現(xiàn)>99.99%單克隆保障與全流程數(shù)字化整合
在生物制藥領(lǐng)域，細(xì)胞株開發(fā)（Cell Line Development, CLD）正經(jīng)歷效率與合規(guī)性的雙重革命。隨著單克隆抗體和基因治療等產(chǎn)品的研發(fā)周期縮短至18至24個(gè)月，傳統(tǒng)技術(shù)面臨三大核心瓶頸：多設(shè)備切換導(dǎo)致的工作流割裂顯著延長研發(fā)周期，分選與成像環(huán)節(jié)的技術(shù)局限使得單克隆性難以保證，而人工操作模式更無法滿足日益嚴(yán)格的監(jiān)管追溯要求。
為應(yīng)對(duì)這些挑戰(zhàn)，德國CYTENA公司研發(fā)的影像式單細(xì)胞打印與成像系統(tǒng)UP.SIGHT 2.0，通過雙重成像驗(yàn)證體系與全流程數(shù)字化整合，重構(gòu)了CLD技術(shù)的范式。
本研究基于16,949孔級(jí)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，系統(tǒng)驗(yàn)證了UP.SIGHT 2.0的單細(xì)胞分選效率（SCDE）和單克隆概率（p(clonal)），并通過培養(yǎng)基與孔板的優(yōu)化提升了克隆恢復(fù)率。數(shù)據(jù)顯示，SCDE超過97%、p(clonal)超過99.99%，克隆回收率高達(dá)80%，結(jié)果表明：UP.SIGHT 2.0覆蓋了單細(xì)胞分選的全流程，確保單克隆性和克隆追蹤，從而加速CLD工作流程。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
1. 單細(xì)胞分選效率（SCDE）驗(yàn)證
研究者通過三項(xiàng)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)（共分配45塊384孔板，分析超17,000孔）評(píng)估了UP.SIGHT 2.0的單細(xì)胞分配效率（SCDE）。每項(xiàng)實(shí)驗(yàn)均使用三臺(tái)UP.SIGHT 2.0以排除儀器特異性因素的影響。
結(jié)果顯示，97.82%的孔含有單細(xì)胞，1.89%為空孔，只有0.29%包含多個(gè)細(xì)胞（多為雙細(xì)胞）。多細(xì)胞孔的主要原因是細(xì)胞重疊（28/48）或與噴嘴壁接近未被識(shí)別（11/48），僅有5例無法通過噴嘴圖像檢測(cè)。空孔主要由于細(xì)胞未分配（38/330）或僅分配碎片（4/330）。UP.SIGHT 2.0的SCDE超過97%，且多細(xì)胞孔比例很低（<0.5%），但后者可能影響單克隆性，因此研究者進(jìn)一步分析了單克隆來源的概率。
2. 單克隆概率（p(clonal)）驗(yàn)證
UP.SIGHT 2.0系統(tǒng)通過單細(xì)胞分配和雙重圖像驗(yàn)證（噴嘴成像與3D全孔成像）來驗(yàn)證單克隆概率。
實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，在優(yōu)化參數(shù)下，噴嘴成像誤差率為0.088%（5/16,949孔），3D成像誤差率為0.139%（11/16,949），兩者同時(shí)出錯(cuò)的概率僅為0.0001225%，單克隆概率達(dá)99.9998775%。即使在次優(yōu)參數(shù)下（人為提高雙細(xì)胞率至16.6%），計(jì)算誤差率仍低于0.000446%，單克隆概率保持99.9955%。即使在觀測(cè)誤差率較高（分別為0.000059%（1例）和0.04%（2例））的情況下，經(jīng)過高估因子校正后實(shí)際概率仍可達(dá)99.9993%。結(jié)果表明，UP.SIGHT 2.0通過嚴(yán)格的圖像驗(yàn)證可將單克隆來源概率穩(wěn)定控制在>99.99%水平。
3. 克隆恢復(fù)優(yōu)化：培養(yǎng)基與孔板的影響
研究表明，克隆恢復(fù)率顯著受培養(yǎng)基和孔板選擇的影響。實(shí)驗(yàn)中使用CHOK1-Her2細(xì)胞評(píng)估不同培養(yǎng)條件，發(fā)現(xiàn)CHOlean培養(yǎng)基的克隆恢復(fù)率優(yōu)于CDCHO，且穩(wěn)定性更高。補(bǔ)充20%的條件培養(yǎng)基可將恢復(fù)率大幅提升至60%-80%。此外，不同廠商的384孔板和96孔板因表面特性、設(shè)計(jì)及成像兼容性等差異，導(dǎo)致恢復(fù)率波動(dòng)較大。通過系統(tǒng)優(yōu)化培養(yǎng)基配方和篩選合適的孔板，可顯著提高單細(xì)胞克隆的成功率，為治療性蛋白生產(chǎn)和基因治療提供可靠支持。
實(shí)驗(yàn)結(jié)論
本研究系統(tǒng)評(píng)估了影像式單細(xì)胞打印與成像系統(tǒng)UP.SIGHT 2.0在細(xì)胞株開發(fā)（CLD）中的關(guān)鍵性能指標(biāo)與創(chuàng)新價(jià)值，揭示了其在單克隆保障、流程整合及成本效益方面的突破性進(jìn)展：
1. 優(yōu)秀的單克隆保障能力
噴嘴高速成像系統(tǒng)：500fps超高速攝像精準(zhǔn)捕捉每個(gè)液滴，實(shí)現(xiàn)97.8%的單細(xì)胞分選效率（SCDE），多細(xì)胞孔率僅0.29%（較FACS降低20倍）。
板底3D全孔成像：專利Z軸成像技術(shù)穿透培養(yǎng)基實(shí)現(xiàn)細(xì)胞3D定位，消除15%的傳統(tǒng)成像盲區(qū)。
雙重驗(yàn)證機(jī)制：兩系統(tǒng)獨(dú)立運(yùn)作，單克隆保證概率>99.99%（置信區(qū)間99%）。
2. 全流程一體化革新：從“多儀器串聯(lián)”到“單平臺(tái)閉環(huán)”
集成單細(xì)胞分選（定位精度±3μm）、實(shí)時(shí)克隆驗(yàn)證與動(dòng)態(tài)生長監(jiān)測(cè)功能，將傳統(tǒng)多設(shè)備串聯(lián)流程簡化為單平臺(tái)操作，減少60%人工干預(yù)。
數(shù)字化溯源系統(tǒng)自動(dòng)生成符合21 CFR Part 11的電子記錄，包括每孔200+張時(shí)間戳圖像、統(tǒng)計(jì)學(xué)置信區(qū)間計(jì)算及CTD格式申報(bào)資料。完整數(shù)據(jù)鏈支持生物制品質(zhì)量追溯，直接滿足基因治療、CAR-T等前沿領(lǐng)域需求。
3. 標(biāo)準(zhǔn)化與指導(dǎo)意義
研究成果不僅驗(yàn)證了UP.SIGHT 2.0系統(tǒng)的可靠性，更為用戶提供了從儀器驗(yàn)證到工藝優(yōu)化的標(biāo)準(zhǔn)化指南，對(duì)提升細(xì)胞株開發(fā)效率、質(zhì)量控制及生物制品申報(bào)具有重要實(shí)踐價(jià)值。
為應(yīng)對(duì)這些挑戰(zhàn)，德國CYTENA公司研發(fā)的影像式單細(xì)胞打印與成像系統(tǒng)UP.SIGHT 2.0，通過雙重成像驗(yàn)證體系與全流程數(shù)字化整合，重構(gòu)了CLD技術(shù)的范式。
本研究基于16,949孔級(jí)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，系統(tǒng)驗(yàn)證了UP.SIGHT 2.0的單細(xì)胞分選效率（SCDE）和單克隆概率（p(clonal)），并通過培養(yǎng)基與孔板的優(yōu)化提升了克隆恢復(fù)率。數(shù)據(jù)顯示，SCDE超過97%、p(clonal)超過99.99%，克隆回收率高達(dá)80%，結(jié)果表明：UP.SIGHT 2.0覆蓋了單細(xì)胞分選的全流程，確保單克隆性和克隆追蹤，從而加速CLD工作流程。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
1. 單細(xì)胞分選效率（SCDE）驗(yàn)證
研究者通過三項(xiàng)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)（共分配45塊384孔板，分析超17,000孔）評(píng)估了UP.SIGHT 2.0的單細(xì)胞分配效率（SCDE）。每項(xiàng)實(shí)驗(yàn)均使用三臺(tái)UP.SIGHT 2.0以排除儀器特異性因素的影響。
結(jié)果顯示，97.82%的孔含有單細(xì)胞，1.89%為空孔，只有0.29%包含多個(gè)細(xì)胞（多為雙細(xì)胞）。多細(xì)胞孔的主要原因是細(xì)胞重疊（28/48）或與噴嘴壁接近未被識(shí)別（11/48），僅有5例無法通過噴嘴圖像檢測(cè)。空孔主要由于細(xì)胞未分配（38/330）或僅分配碎片（4/330）。UP.SIGHT 2.0的SCDE超過97%，且多細(xì)胞孔比例很低（<0.5%），但后者可能影響單克隆性，因此研究者進(jìn)一步分析了單克隆來源的概率。
2. 單克隆概率（p(clonal)）驗(yàn)證
UP.SIGHT 2.0系統(tǒng)通過單細(xì)胞分配和雙重圖像驗(yàn)證（噴嘴成像與3D全孔成像）來驗(yàn)證單克隆概率。
實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，在優(yōu)化參數(shù)下，噴嘴成像誤差率為0.088%（5/16,949孔），3D成像誤差率為0.139%（11/16,949），兩者同時(shí)出錯(cuò)的概率僅為0.0001225%，單克隆概率達(dá)99.9998775%。即使在次優(yōu)參數(shù)下（人為提高雙細(xì)胞率至16.6%），計(jì)算誤差率仍低于0.000446%，單克隆概率保持99.9955%。即使在觀測(cè)誤差率較高（分別為0.000059%（1例）和0.04%（2例））的情況下，經(jīng)過高估因子校正后實(shí)際概率仍可達(dá)99.9993%。結(jié)果表明，UP.SIGHT 2.0通過嚴(yán)格的圖像驗(yàn)證可將單克隆來源概率穩(wěn)定控制在>99.99%水平。
3. 克隆恢復(fù)優(yōu)化：培養(yǎng)基與孔板的影響
研究表明，克隆恢復(fù)率顯著受培養(yǎng)基和孔板選擇的影響。實(shí)驗(yàn)中使用CHOK1-Her2細(xì)胞評(píng)估不同培養(yǎng)條件，發(fā)現(xiàn)CHOlean培養(yǎng)基的克隆恢復(fù)率優(yōu)于CDCHO，且穩(wěn)定性更高。補(bǔ)充20%的條件培養(yǎng)基可將恢復(fù)率大幅提升至60%-80%。此外，不同廠商的384孔板和96孔板因表面特性、設(shè)計(jì)及成像兼容性等差異，導(dǎo)致恢復(fù)率波動(dòng)較大。通過系統(tǒng)優(yōu)化培養(yǎng)基配方和篩選合適的孔板，可顯著提高單細(xì)胞克隆的成功率，為治療性蛋白生產(chǎn)和基因治療提供可靠支持。
實(shí)驗(yàn)結(jié)論
本研究系統(tǒng)評(píng)估了影像式單細(xì)胞打印與成像系統(tǒng)UP.SIGHT 2.0在細(xì)胞株開發(fā)（CLD）中的關(guān)鍵性能指標(biāo)與創(chuàng)新價(jià)值，揭示了其在單克隆保障、流程整合及成本效益方面的突破性進(jìn)展：
1. 優(yōu)秀的單克隆保障能力
噴嘴高速成像系統(tǒng)：500fps超高速攝像精準(zhǔn)捕捉每個(gè)液滴，實(shí)現(xiàn)97.8%的單細(xì)胞分選效率（SCDE），多細(xì)胞孔率僅0.29%（較FACS降低20倍）。
板底3D全孔成像：專利Z軸成像技術(shù)穿透培養(yǎng)基實(shí)現(xiàn)細(xì)胞3D定位，消除15%的傳統(tǒng)成像盲區(qū)。
雙重驗(yàn)證機(jī)制：兩系統(tǒng)獨(dú)立運(yùn)作，單克隆保證概率>99.99%（置信區(qū)間99%）。
2. 全流程一體化革新：從“多儀器串聯(lián)”到“單平臺(tái)閉環(huán)”
集成單細(xì)胞分選（定位精度±3μm）、實(shí)時(shí)克隆驗(yàn)證與動(dòng)態(tài)生長監(jiān)測(cè)功能，將傳統(tǒng)多設(shè)備串聯(lián)流程簡化為單平臺(tái)操作，減少60%人工干預(yù)。
數(shù)字化溯源系統(tǒng)自動(dòng)生成符合21 CFR Part 11的電子記錄，包括每孔200+張時(shí)間戳圖像、統(tǒng)計(jì)學(xué)置信區(qū)間計(jì)算及CTD格式申報(bào)資料。完整數(shù)據(jù)鏈支持生物制品質(zhì)量追溯，直接滿足基因治療、CAR-T等前沿領(lǐng)域需求。
3. 標(biāo)準(zhǔn)化與指導(dǎo)意義
研究成果不僅驗(yàn)證了UP.SIGHT 2.0系統(tǒng)的可靠性，更為用戶提供了從儀器驗(yàn)證到工藝優(yōu)化的標(biāo)準(zhǔn)化指南，對(duì)提升細(xì)胞株開發(fā)效率、質(zhì)量控制及生物制品申報(bào)具有重要實(shí)踐價(jià)值。
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