染色質免疫共沉淀ChIP實驗的詳細實驗步驟
染色質免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)，是研究體內蛋白質與DNA相互作用的經典方法。
開始 ChIP 之前要考慮三件事
（1）為您的實驗查找適合的抗體
（2）優化染色質剪切
（3）評估您的 ChIP 實驗能否成功
五個步驟獲得理想 ChIP 結果
Step1：交聯和裂解——穩定復合物并分離核組分
第一步對時間要求嚴格并且需要優化。體內共價交聯穩定蛋白質-DNA相互作用并于特定時間點進行分析。通常采用甲醛交聯，加入甘氨酸以終止反應。交聯劑滲透到完整細胞中并將蛋白質-DNA復合物鎖定在一起從而進行分析。交聯劑在整個過程中保持復合物穩定，但其作用必須是可逆的才能用于ChIP。一些非常穩定的蛋白質-DNA相互作用則不需要交聯。
接下來，使用裂解液透化細胞膜，釋放細胞組分，然后蛋白質-DNA復合物變得可溶。去除細胞溶質蛋白以減少背景信號并增加靈敏度。
注意：此時可以停止ChIP測定。 經過交聯，淬滅和洗滌細胞沉淀后，將裂解物于-80℃儲存。
Step2：染色質片段化——DNA片段化
細胞核材料片段化是獲得良好的ChIP 分辨率的關鍵因素，理想情況下的片段大小在 200 到 800 bp對之間。剪切是最難控制的步驟之一。通過超聲處理和/或核酸酶/酶促消化可以實現剪切，各有利弊。超聲處理需要大量的手動操作時間，但非常適合難以裂解的細胞；酶促消化不需要手動操作，適用于大量樣品的處理，但其剪切位點不是隨機的。兩種方法都需要根據具體細胞系進行優化。
注意：此時可以停止ChIP。經過剪切/消化染色質后，可以將樣品于-80°C儲存。避免反復凍融。
Step3：免疫沉淀——捕獲并分離蛋白質-DNA復合物
使用抗體捕獲蛋白質-DNA復合物中的目標蛋白質是實驗成功的關鍵因素。抗體免疫沉淀并從細胞核組分中分離蛋白質，去除不相關的細胞物質。
使用抗體結合磁珠完成所得抗體-蛋白質-DNA復合物的純化。經過孵育后，充分洗滌磁珠-抗體-蛋白質-DNA復合物，純化并洗脫蛋白質-DNA復合物。
Step4：制備DNA——解交聯和DNA純化
現在含有目標蛋白質的染色質片段已分離，需要解交聯并純化DNA。解交聯通常采用高熱孵育和/或消化來完成。
注意：此時可以停止ChIP。經過解交聯和/或DNA純化后，可以將樣品于-20°C儲存。
Step5：定量DNA——測定目標蛋白質-DNA水平
在該步驟中，通過qPCR定量純化的DNA產物，通過qPCR，您可以確定目標蛋白是否存在于特定位點。
參考文獻：
開始 ChIP 之前要考慮三件事
（1）為您的實驗查找適合的抗體
（2）優化染色質剪切
（3）評估您的 ChIP 實驗能否成功
五個步驟獲得理想 ChIP 結果
Step1：交聯和裂解——穩定復合物并分離核組分
第一步對時間要求嚴格并且需要優化。體內共價交聯穩定蛋白質-DNA相互作用并于特定時間點進行分析。通常采用甲醛交聯，加入甘氨酸以終止反應。交聯劑滲透到完整細胞中并將蛋白質-DNA復合物鎖定在一起從而進行分析。交聯劑在整個過程中保持復合物穩定，但其作用必須是可逆的才能用于ChIP。一些非常穩定的蛋白質-DNA相互作用則不需要交聯。
接下來，使用裂解液透化細胞膜，釋放細胞組分，然后蛋白質-DNA復合物變得可溶。去除細胞溶質蛋白以減少背景信號并增加靈敏度。
注意：此時可以停止ChIP測定。 經過交聯，淬滅和洗滌細胞沉淀后，將裂解物于-80℃儲存。
Step2：染色質片段化——DNA片段化
細胞核材料片段化是獲得良好的ChIP 分辨率的關鍵因素，理想情況下的片段大小在 200 到 800 bp對之間。剪切是最難控制的步驟之一。通過超聲處理和/或核酸酶/酶促消化可以實現剪切，各有利弊。超聲處理需要大量的手動操作時間，但非常適合難以裂解的細胞；酶促消化不需要手動操作，適用于大量樣品的處理，但其剪切位點不是隨機的。兩種方法都需要根據具體細胞系進行優化。
注意：此時可以停止ChIP。經過剪切/消化染色質后，可以將樣品于-80°C儲存。避免反復凍融。
Step3：免疫沉淀——捕獲并分離蛋白質-DNA復合物
使用抗體捕獲蛋白質-DNA復合物中的目標蛋白質是實驗成功的關鍵因素。抗體免疫沉淀并從細胞核組分中分離蛋白質，去除不相關的細胞物質。
使用抗體結合磁珠完成所得抗體-蛋白質-DNA復合物的純化。經過孵育后，充分洗滌磁珠-抗體-蛋白質-DNA復合物，純化并洗脫蛋白質-DNA復合物。
Step4：制備DNA——解交聯和DNA純化
現在含有目標蛋白質的染色質片段已分離，需要解交聯并純化DNA。解交聯通常采用高熱孵育和/或消化來完成。
注意：此時可以停止ChIP。經過解交聯和/或DNA純化后，可以將樣品于-20°C儲存。
Step5：定量DNA——測定目標蛋白質-DNA水平
在該步驟中，通過qPCR定量純化的DNA產物，通過qPCR，您可以確定目標蛋白是否存在于特定位點。
參考文獻：
- thermofisher
- doi.org/10.1038/s41467-020-18900-z
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