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WGBS及多組學(xué)研究揭示納米塑料暴露對(duì)藻類(lèi)初級(jí)生產(chǎn)力的表觀調(diào)控機(jī)制
近日，中山大學(xué)（深圳校區(qū)）農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院劉賽博博士等為第一作者，中山大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院黃曉辰副教授、中國(guó)海洋大學(xué)jian zhao為共同通訊作者，在納米科學(xué)領(lǐng)域王牌期刊《ACS Nano》發(fā)表題為《Genome-Wide Molecular Adaptation in Algal Primary Productivity Induced by Prolonged Exposure to Environmentally Realistic Concentration of Nanoplastics》研究論文。研究探討了納米塑料（Nanoplastics, NPs）在環(huán)境相關(guān)濃度下對(duì)藻類(lèi)（algae）初級(jí)生產(chǎn)力（Primary Productivity）的長(zhǎng)期作用影響。研究人員選擇三種不同電荷的聚苯乙烯納米塑料（nPS、nPS-NH₂和nPS-COOH），以10 μg/L的環(huán)境相關(guān)濃度暴露于小球藻（Chlorella sp.）100天，通過(guò)表觀基因組學(xué)（WGBS）和轉(zhuǎn)錄組學(xué)（RNA-seq）整合分析揭示了藻類(lèi)對(duì)納米塑料的表觀遺傳適應(yīng)機(jī)制，為環(huán)境應(yīng)激下的生物適應(yīng)性研究提供新的方法和理論基礎(chǔ)。
標(biāo)題：Genome-Wide Molecular Adaptation in Algal Primary Productivity Induced by Prolonged Exposure to Environmentally Realistic Concentration of Nanoplastics（由環(huán)境相關(guān)濃度的納米塑料長(zhǎng)期暴露引起的藻類(lèi)初級(jí)生產(chǎn)力的全基因組分子適應(yīng)）
時(shí)間：2024年10月19日
期刊：ACS Nano
影響因子：IF16/Q1
技術(shù)平臺(tái)：WGBS、RNA-seq
作者單位：中山大學(xué)深圳校區(qū)劉賽博、黃曉辰等
DOI：10.1021/acsnano.4c09709
本研究結(jié)果表明，藻類(lèi)通過(guò)增加藻的數(shù)量（10.34–16.52%）、葉綠素a（Chl a）（11.28–17.65%）和碳固定酶活性（49.19–68.33%）適應(yīng)了這三種類(lèi)型的納米塑料（nPS、nPS-NH₂和nPS-COOH），這一結(jié)果也通過(guò)自然水體培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)得到了進(jìn)一步證實(shí)。在個(gè)體水平上，基于藻類(lèi)葉綠體數(shù)量和生物體積的分析，只有nPS導(dǎo)致藻類(lèi)分化為兩個(gè)異質(zhì)亞群（54.92% vs 45.08%），而nPS-NH₂和nPS-COOH并未引起藻類(lèi)群體分化。通過(guò)整合表觀基因組學(xué)（WGBS）和轉(zhuǎn)錄組學(xué)（RNA-seq）揭示了藻類(lèi)對(duì)納米塑料的分子適應(yīng)機(jī)制。藻類(lèi)在暴露于nPS、nPS-NH₂和nPS-COOH時(shí)的平均甲基化率顯著升高。與nPS和nPS-NH₂相比，暴露于nPS-COOH時(shí)通過(guò)差異甲基化區(qū)域（differentially methylated regions，DMRs）調(diào)控基因表達(dá)方向差異。本研究結(jié)果強(qiáng)調(diào)了評(píng)估納米塑料長(zhǎng)期生態(tài)毒性的重要性，并為理解納米塑料對(duì)水生生態(tài)系統(tǒng)的影響提供有用信息。
圖形摘要
易小結(jié)
本研究以環(huán)境真實(shí)濃度的納米塑料長(zhǎng)期暴露小球藻，整合易基因科技提供的WGBS＋RNA-seq技術(shù)，從群體、個(gè)體到分子層面揭示藻類(lèi)通過(guò)啟動(dòng)子/genebody DNA甲基化重塑與轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)重編程，實(shí)現(xiàn)了初級(jí)生產(chǎn)力提升并可跨代傳遞。
易基因提供的“甲基化-基因表達(dá)”多組學(xué)分析不僅助力闡明“長(zhǎng)期低劑量暴露產(chǎn)生何種生物學(xué)效應(yīng)”，更為環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警、綠色農(nóng)業(yè)、健康毒理評(píng)估提供可復(fù)制、可擴(kuò)展的“表觀遺傳學(xué)”研究范式：覆蓋更多物種、更多不同脅迫場(chǎng)景的領(lǐng)先技術(shù)服務(wù)。
研究方法
（1）納米塑料表征：掃描電子顯微鏡（SEM）觀察納米塑料的形態(tài)和粒徑，X射線光電子能譜（XPS）分析納米塑料表面官能團(tuán)，Zeta電位測(cè)定納米塑料在藻類(lèi)培養(yǎng)基中的電荷特性。
（2）藻類(lèi)培養(yǎng)與長(zhǎng)期暴露實(shí)驗(yàn)：小球藻（Chlorella sp.）暴露濃度為10μg/L，25°C，14/10 h光暗周期，光照強(qiáng)度100 μmol/m²/s。半連續(xù)培養(yǎng)模式，每120小時(shí)更換一次新鮮培養(yǎng)基，持續(xù)100天。
（3）生理指標(biāo)測(cè)定：細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（Countstar）測(cè)定細(xì)胞數(shù)量，干重法測(cè)定生物量，分光光度法測(cè)定葉綠素a，葉綠素?zé)晒鈨x測(cè)定最大電子傳遞速率（rETRmax），酶活測(cè)定RuBisCo活性，DCFH-DA熒光探針測(cè)定ROS水平。
（4）單細(xì)胞水平分析：流式細(xì)胞術(shù)（Flow Cytometry）測(cè)定每個(gè)細(xì)胞葉綠體數(shù)量，熒光激活細(xì)胞分選（FACS）不同葉綠體表達(dá)水平亞群。
（5）表觀基因組學(xué)（WGBS）和轉(zhuǎn)錄組學(xué)（RNA-seq）：全基因組重亞硫酸鹽測(cè)序（WGBS）分析DNA甲基化變化，RNA-seq分析基因表達(dá)變化。
結(jié)果圖形
（1）長(zhǎng)期NPs暴露提升藻類(lèi)初級(jí)生產(chǎn)力
在長(zhǎng)達(dá)100天的納米塑料（NPs）暴露實(shí)驗(yàn)中，研究人員發(fā)現(xiàn)藻類(lèi)的初級(jí)生產(chǎn)力得到顯著提升。藻類(lèi)細(xì)胞數(shù)量在nPS、nPS-COOH和nPS-NH₂暴露組分別增加了16.50%、13.03%和10.32%。葉綠素a（Chl a）含量增加了11.28%-17.65%。然而，藻類(lèi)生物量?jī)HnPS和nPS-COOH暴露組增加，nPS-NH₂暴露組無(wú)顯著變化。藻類(lèi)的最大相對(duì)電子傳遞速率（rETRmax）在nPS和nPS-COOH暴露組中有所增加，且nPS-COOH暴露組的增加幅度最大。藻類(lèi)通過(guò)光合作用固定二氧化碳的能力也得到了增強(qiáng)，這體現(xiàn)在所有三種類(lèi)型的NPs均提高了RuBisCo活性（49.19%–68.33%）。研究人員還在自然水體中進(jìn)行了暴露實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，在經(jīng)過(guò)100天的暴露后，nPS和nPS-COOH暴露組的藻類(lèi)細(xì)胞數(shù)量、生物量和Chl a均有所增加，這與在超純水制備的培養(yǎng)基中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。然而，nPS-NH₂暴露組的Chl a增加并不顯著，這可能是由于nPS-NH₂與自然水體中的有機(jī)物結(jié)合，減少了與藻類(lèi)細(xì)胞的接觸。
（B-G）藻類(lèi)菌株在實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)期間的（B）葉綠素a（Chl a）含量、（C）藻類(lèi)細(xì)胞數(shù)量、（D）葉綠素a含量、（E）生物量、（F）生物體積、（G）最大相對(duì)電子傳遞速率（rETRmax）。
（H-J）藻類(lèi)在適應(yīng)三種NPs 100天后的（H）RuBisCo活性、（I）藻類(lèi)細(xì)胞數(shù)量、（J）葉綠素a含量。（K） 藻類(lèi)在自然水體培養(yǎng)系統(tǒng)中暴露于三種NPs（100天）后的生物量。
（2）藻類(lèi)初級(jí)生產(chǎn)力的個(gè)體性狀分化
為了進(jìn)一步揭示不同表面電荷的NPs對(duì)藻類(lèi)初級(jí)生產(chǎn)力響應(yīng)的差異，研究人員在個(gè)體水平上評(píng)估了藻類(lèi)的葉綠體數(shù)量。結(jié)果顯示，藻類(lèi)細(xì)胞的平均葉綠體數(shù)量并未受到長(zhǎng)期NPs適應(yīng)的影響。盡管在三種NPs暴露組之間葉綠體體積沒(méi)有顯著差異，但在nPS暴露組中，從均質(zhì)藻類(lèi)群體中出現(xiàn)了兩個(gè)具有低水平（P1）和高水平（P2）葉綠體表達(dá)的亞群。相比之下，nPS-COOH和nPS-NH₂暴露組并未表現(xiàn)出顯著的分化現(xiàn)象。P1亞群（占總細(xì)胞數(shù)的54.92%）的平均信號(hào)強(qiáng)度顯著下降至對(duì)照組的67.65%，而P2亞群（占總細(xì)胞數(shù)的45.08%）則顯著增加至對(duì)照組的131.64%。研究人員使用流式細(xì)胞儀（FACS）從大量藻類(lèi)懸浮液中分選出了P1和P2亞群，分選效率超過(guò)95%。觀察P1和P2亞群的細(xì)胞形態(tài)發(fā)現(xiàn)，P2的生物體積比P1高出1.41倍。這種在nPS暴露下出現(xiàn)的亞群分化現(xiàn)象可能歸因于藻類(lèi)的異質(zhì)性。長(zhǎng)期暴露于NPs的藻類(lèi)與NPs之間的相互作用可能會(huì)觸發(fā)可遺傳的表型多樣性和生理特征的分化。在長(zhǎng)期NPs暴露后，觀察到藻類(lèi)初級(jí)生產(chǎn)力在群體水平上有所提高，而在個(gè)體水平上則表現(xiàn)出明顯的性狀分化，這表明藻類(lèi)基因組在適應(yīng)NPs的過(guò)程中發(fā)生了改變。
（B-C）有無(wú)NPs處理的藻類(lèi)細(xì)胞在個(gè)體水平上的分布情況。
（D）P1和P2的代表性圖像及生物體積分布統(tǒng)計(jì)。
（E）P1和P2中藻類(lèi)細(xì)胞的生物體積。
（3）NPs長(zhǎng)期適應(yīng)后藻類(lèi)的全基因組DNA甲基化變化
為全面理解藻類(lèi)初級(jí)生產(chǎn)力的提升，研究人員利用全基因組重亞硫酸鹽測(cè)序（WGBS）技術(shù)，在單堿基分辨率下分析了小球藻在長(zhǎng)期暴露于三種NPs后的DNA甲基化圖譜，并觀察到基因組水平上的變化。在對(duì)照組和暴露組中，藻類(lèi)的甲基化位點(diǎn)數(shù)量在10.62M-19.17M，亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化率高于99%，表明原始數(shù)據(jù)的完整性和可靠性。從平均甲基化率結(jié)果來(lái)看，與對(duì)照組相比，暴露于nPS、nPS-COOH和nPS-NH₂的藻類(lèi)發(fā)生高甲基化。5-甲基胞嘧啶（5mC）的甲基化水平也呈現(xiàn)出類(lèi)似的基因組特征。整體甲基化率從對(duì)照組的0.88%顯著上升至nPS、nPS-COOH和nPS-NH₂暴露組的0.90%、0.89%和0.90%。更多的高甲基化差異甲基化區(qū)域（DMRs）導(dǎo)致甲基化水平增加。5mC主要分布在CG位點(diǎn)（對(duì)照組為0.83%，nPS為0.84%，nPS-COOH為0.83%，nPS-NH₂為0.84%），其次是CHG和CHH位點(diǎn)。與先前的一項(xiàng)研究類(lèi)似，無(wú)論NPs類(lèi)型如何，CG位點(diǎn)的甲基化水平和覆蓋率均高于CHG和CHH。因此，與CHG和CHH相比，CG位點(diǎn)更適合用于分析在長(zhǎng)期NPs暴露下基因組信息的適應(yīng)性變化。鑒于相鄰的甲基化位點(diǎn)通常協(xié)同作用，基因表達(dá)的變化高度依賴于低甲基化和高甲基化DMRs的水平。
（B）5mC在功能基因組區(qū)域的相對(duì)密度分布。
（C）藻類(lèi)在有無(wú)NPs處理下的平均甲基化率。
（D）暴露于三種NPs后的差異甲基化區(qū)域（DMRs）的數(shù)量。
（E-G）CG、CHG和CHH的（E）平均甲基化率，（F）甲基化水平，（G）在對(duì)照組中的甲基化深度。
（4）藻類(lèi)DMRs對(duì)NPs的適應(yīng)性變化
研究人員進(jìn)一步通過(guò)比較nPS、nPS-COOH和nPS-NH₂組與對(duì)照組的CG位點(diǎn)檢測(cè)了DMRs。結(jié)果顯示， nPS暴露組有534個(gè)高甲基化DMRs和209個(gè)低甲基化DMRs，nPS-COOH暴露組有497個(gè)高甲基化DMRs和310個(gè)低甲基化DMRs，nPS-NH₂暴露組有660個(gè)高甲基化DMRs和470個(gè)低甲基化DMRs。因此，在暴露于三種類(lèi)型的NPs后，高甲基化DMRs的數(shù)量均多于低甲基化DMRs。研究人員利用高甲基化區(qū)域?yàn)槊總�(gè)基因組scaffold構(gòu)建了甲基化圖譜。DMRs在基因組中的分布顯示出在每個(gè)暴露組的所有支架中均呈現(xiàn)出高甲基化趨勢(shì)。在DMRs的基因組位點(diǎn)（啟動(dòng)子、外顯子、內(nèi)含子、3'UTR和5'UTR）中，位于啟動(dòng)子和外顯子區(qū)域的DMRs數(shù)量多于內(nèi)含子區(qū)域。任何NPs處理均能誘導(dǎo)更多的高甲基化DMRs位于啟動(dòng)子區(qū)域，而在內(nèi)含子區(qū)域則較少。為了闡釋DMRs的功能，研究人員利用啟動(dòng)子相關(guān)DMRs關(guān)聯(lián)基因（DMGs）進(jìn)行了KEGG功能富集分析。分析結(jié)果表明，暴露于NPs后的高甲基化DMRs和低甲基化DMRs均富集在一系列生物代謝過(guò)程（如“光合作用”和“甘油脂代謝”）中，這可能與藻類(lèi)在長(zhǎng)期NPs暴露后初級(jí)生產(chǎn)力的提升有關(guān)。
（B）DMRs在基因組位點(diǎn)（啟動(dòng)子、外顯子、內(nèi)含子、3'UTR和5'UTR）中的分布情況。
（C）在啟動(dòng)子和genebody區(qū)域鑒定的DMRs的KEGG功能富集分析。
（5）藻類(lèi)長(zhǎng)期適應(yīng)后的轉(zhuǎn)錄組變化
為將藻類(lèi)初級(jí)生產(chǎn)力的全基因組變化與生理變化聯(lián)系起來(lái)，研究人員利用RNA-seq技術(shù)確定了藻類(lèi)在長(zhǎng)期暴露于三種NPs后的轉(zhuǎn)錄組變化。轉(zhuǎn)錄組結(jié)果顯示，nPS-COOH暴露組引起的差異表達(dá)基因（DEGs）數(shù)量顯著多于nPS和nPS-NH₂暴露組。此外研究人員還對(duì)DEGs進(jìn)行注釋?zhuān)⑦M(jìn)行基因集富集分析（GSEA）以研究轉(zhuǎn)錄組變化功能。一系列與氨基酸和肽鏈合成相關(guān)通路（如tRNA生物合成、核糖體和核糖體生物合成）被三種類(lèi)型的NPs抑制，表明所有三種類(lèi)型NPs都能干擾蛋白質(zhì)合成。外泌體通路被所有三種NPs上調(diào)，這一過(guò)程有助于從衰老細(xì)胞中清除ROS、氧化脂質(zhì)和其他有害代謝物，從而重新啟動(dòng)藻類(lèi)增殖。光合作用蛋白通路在nPS-NH₂處理下顯著下調(diào)。這一結(jié)果與DMRs富集結(jié)果一致（圖4C），可能解釋了為什么在nPS-NH₂處理后藻類(lèi)生物量和生物體積沒(méi)有顯著變化（圖1E、F）。
（6）NPs長(zhǎng)期適應(yīng)后基因組變化與基因表達(dá)水平的關(guān)系
研究人員進(jìn)一步分析了甲基化組和轉(zhuǎn)錄組的結(jié)果，以揭示藻類(lèi)在長(zhǎng)期NPs暴露下受到影響的分子機(jī)制。DMGs和DEGs的整合分析結(jié)果揭示了nPS-COOH的DEGs數(shù)量多于其他兩組，因此在nPS-COOH暴露組中鑒定出的候選基因最多（69個(gè)）。本研究通過(guò)啟動(dòng)子相關(guān)DMRs關(guān)聯(lián)基因（PDMGs）與DEGs篩選出的候選基因富集于一系列通路，如蛋白質(zhì)代謝過(guò)程、蛋白水解和含氮有機(jī)化合物代謝過(guò)程。相比之下，通過(guò)genebody（基因體）相關(guān)DMRs關(guān)聯(lián)基因（GDMGs）與DEGs篩選出的候選基因富集于催化活性的正向調(diào)控、分子功能和水解酶活性等通路。這一結(jié)果表明碳和氮的代謝受啟動(dòng)子區(qū)域甲基化調(diào)控。這些通路的調(diào)控可能代表了藻類(lèi)對(duì)長(zhǎng)期NPs暴露的適應(yīng)性響應(yīng)，并進(jìn)一步影響下游功能。基因表達(dá)與DNA甲基化之間的Pearson相關(guān)性分析結(jié)果表明，PDMGs在nPS和nPS-NH₂暴露組中與DEGs呈負(fù)相關(guān)，在nPS-COOH暴露組中則呈正相關(guān)。而GDMGs在nPS和nPS-NH₂暴露組中與DEGs呈正相關(guān)，但在nPS-COOH暴露下則呈負(fù)相關(guān)。先前研究已經(jīng)表明，啟動(dòng)子區(qū)域高甲基化和基因體區(qū)域的低甲基化會(huì)抑制目標(biāo)基因表達(dá)，而啟動(dòng)子區(qū)域低甲基化和基因體區(qū)域高甲基化則會(huì)促進(jìn)目標(biāo)基因表達(dá)。nPS和nPS-NH₂暴露組中DMRs和DEGs的相關(guān)性與先前的研究結(jié)果一致，但nPS-COOH暴露組的相關(guān)性則與先前研究結(jié)果相反。DNA甲基化對(duì)轉(zhuǎn)錄調(diào)控的負(fù)調(diào)控方向表明，nPS-COOH可能會(huì)導(dǎo)致藻類(lèi)基因轉(zhuǎn)錄沉默，而nPS和nPS-NH₂則不會(huì)。這表明在長(zhǎng)期暴露于不同電荷的NPs后，藻類(lèi)在基因組水平上的適應(yīng)策略存在差異。
(B) 下調(diào)的DEGs與基因體相關(guān)低甲基化DMRs關(guān)聯(lián)基因（GDMGs）。
(C) 上調(diào)的DEGs與低甲基化PDMRs。
(D) 上調(diào)的DEGs與高甲基化GDMRs。
(E) 對(duì)于(A)和(C)中的候選基因進(jìn)行GO功能富集分析；
(F) 對(duì)于(B)和(D)中的候選基因進(jìn)行GO功能富集分析；
(G) 暴露于三種NPs后，每個(gè)基因的基因表達(dá)與DNA甲基化之間的Pearson相關(guān)性分析。
討論和啟示
與短期高濃度暴露相比，長(zhǎng)期低濃度暴露更能反映納米塑料在環(huán)境中的真實(shí)影響。DNA甲基化作為一種表觀遺傳修飾，可能通過(guò)調(diào)控基因表達(dá)幫助藻類(lèi)適應(yīng)納米塑料的長(zhǎng)期暴露。納米塑料可能通過(guò)增強(qiáng)藻類(lèi)初級(jí)生產(chǎn)力，影響水生生態(tài)系統(tǒng)的碳循環(huán)和能量傳遞。本研究結(jié)果提示，納米塑料的生態(tài)毒理學(xué)評(píng)估需要考慮長(zhǎng)期低濃度暴露的影響。
WGBS和RNA-seq技術(shù)為揭示藻類(lèi)對(duì)納米塑料的適應(yīng)性機(jī)制提供了重要工具
WGBS：通過(guò)全基因組重亞硫酸鹽測(cè)序，研究揭示了藻類(lèi)在納米塑料長(zhǎng)期暴露下的DNA甲基化變化，為理解藻類(lèi)的表觀遺傳適應(yīng)機(jī)制提供重要數(shù)據(jù)。
RNA-seq：通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序研究分析藻類(lèi)基因表達(dá)的變化，揭示納米塑料對(duì)藻類(lèi)生理功能的影響。
整合分析：WGBS和RNA-seq技術(shù)的關(guān)聯(lián)分析，從基因組和轉(zhuǎn)錄組兩個(gè)層面全面解析藻類(lèi)對(duì)納米塑料的適應(yīng)性機(jī)制，為環(huán)境應(yīng)激下的生物適應(yīng)性研究提供了新的方法和理論基礎(chǔ)。
參考文獻(xiàn)：
Liu S, Huang X, Han J, Yao L, Li H, Xin G, Ho SH, Zhao J, Xing B. Genome-Wide Molecular Adaptation in Algal Primary Productivity Induced by Prolonged Exposure to Environmentally Realistic Concentration of Nanoplastics. ACS Nano. 2024 Oct 19. doi: 10.1021/acsnano.4c09709.
標(biāo)題：Genome-Wide Molecular Adaptation in Algal Primary Productivity Induced by Prolonged Exposure to Environmentally Realistic Concentration of Nanoplastics（由環(huán)境相關(guān)濃度的納米塑料長(zhǎng)期暴露引起的藻類(lèi)初級(jí)生產(chǎn)力的全基因組分子適應(yīng)）
時(shí)間：2024年10月19日
期刊：ACS Nano
影響因子：IF16/Q1
技術(shù)平臺(tái)：WGBS、RNA-seq
作者單位：中山大學(xué)深圳校區(qū)劉賽博、黃曉辰等
DOI：10.1021/acsnano.4c09709
本研究結(jié)果表明，藻類(lèi)通過(guò)增加藻的數(shù)量（10.34–16.52%）、葉綠素a（Chl a）（11.28–17.65%）和碳固定酶活性（49.19–68.33%）適應(yīng)了這三種類(lèi)型的納米塑料（nPS、nPS-NH₂和nPS-COOH），這一結(jié)果也通過(guò)自然水體培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)得到了進(jìn)一步證實(shí)。在個(gè)體水平上，基于藻類(lèi)葉綠體數(shù)量和生物體積的分析，只有nPS導(dǎo)致藻類(lèi)分化為兩個(gè)異質(zhì)亞群（54.92% vs 45.08%），而nPS-NH₂和nPS-COOH并未引起藻類(lèi)群體分化。通過(guò)整合表觀基因組學(xué)（WGBS）和轉(zhuǎn)錄組學(xué)（RNA-seq）揭示了藻類(lèi)對(duì)納米塑料的分子適應(yīng)機(jī)制。藻類(lèi)在暴露于nPS、nPS-NH₂和nPS-COOH時(shí)的平均甲基化率顯著升高。與nPS和nPS-NH₂相比，暴露于nPS-COOH時(shí)通過(guò)差異甲基化區(qū)域（differentially methylated regions，DMRs）調(diào)控基因表達(dá)方向差異。本研究結(jié)果強(qiáng)調(diào)了評(píng)估納米塑料長(zhǎng)期生態(tài)毒性的重要性，并為理解納米塑料對(duì)水生生態(tài)系統(tǒng)的影響提供有用信息。
圖形摘要
易小結(jié)
本研究以環(huán)境真實(shí)濃度的納米塑料長(zhǎng)期暴露小球藻，整合易基因科技提供的WGBS＋RNA-seq技術(shù)，從群體、個(gè)體到分子層面揭示藻類(lèi)通過(guò)啟動(dòng)子/genebody DNA甲基化重塑與轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)重編程，實(shí)現(xiàn)了初級(jí)生產(chǎn)力提升并可跨代傳遞。
易基因提供的“甲基化-基因表達(dá)”多組學(xué)分析不僅助力闡明“長(zhǎng)期低劑量暴露產(chǎn)生何種生物學(xué)效應(yīng)”，更為環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警、綠色農(nóng)業(yè)、健康毒理評(píng)估提供可復(fù)制、可擴(kuò)展的“表觀遺傳學(xué)”研究范式：覆蓋更多物種、更多不同脅迫場(chǎng)景的領(lǐng)先技術(shù)服務(wù)。
研究方法
（1）納米塑料表征：掃描電子顯微鏡（SEM）觀察納米塑料的形態(tài)和粒徑，X射線光電子能譜（XPS）分析納米塑料表面官能團(tuán)，Zeta電位測(cè)定納米塑料在藻類(lèi)培養(yǎng)基中的電荷特性。
（2）藻類(lèi)培養(yǎng)與長(zhǎng)期暴露實(shí)驗(yàn)：小球藻（Chlorella sp.）暴露濃度為10μg/L，25°C，14/10 h光暗周期，光照強(qiáng)度100 μmol/m²/s。半連續(xù)培養(yǎng)模式，每120小時(shí)更換一次新鮮培養(yǎng)基，持續(xù)100天。
（3）生理指標(biāo)測(cè)定：細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（Countstar）測(cè)定細(xì)胞數(shù)量，干重法測(cè)定生物量，分光光度法測(cè)定葉綠素a，葉綠素?zé)晒鈨x測(cè)定最大電子傳遞速率（rETRmax），酶活測(cè)定RuBisCo活性，DCFH-DA熒光探針測(cè)定ROS水平。
（4）單細(xì)胞水平分析：流式細(xì)胞術(shù)（Flow Cytometry）測(cè)定每個(gè)細(xì)胞葉綠體數(shù)量，熒光激活細(xì)胞分選（FACS）不同葉綠體表達(dá)水平亞群。
（5）表觀基因組學(xué)（WGBS）和轉(zhuǎn)錄組學(xué)（RNA-seq）：全基因組重亞硫酸鹽測(cè)序（WGBS）分析DNA甲基化變化，RNA-seq分析基因表達(dá)變化。
結(jié)果圖形
（1）長(zhǎng)期NPs暴露提升藻類(lèi)初級(jí)生產(chǎn)力
在長(zhǎng)達(dá)100天的納米塑料（NPs）暴露實(shí)驗(yàn)中，研究人員發(fā)現(xiàn)藻類(lèi)的初級(jí)生產(chǎn)力得到顯著提升。藻類(lèi)細(xì)胞數(shù)量在nPS、nPS-COOH和nPS-NH₂暴露組分別增加了16.50%、13.03%和10.32%。葉綠素a（Chl a）含量增加了11.28%-17.65%。然而，藻類(lèi)生物量?jī)HnPS和nPS-COOH暴露組增加，nPS-NH₂暴露組無(wú)顯著變化。藻類(lèi)的最大相對(duì)電子傳遞速率（rETRmax）在nPS和nPS-COOH暴露組中有所增加，且nPS-COOH暴露組的增加幅度最大。藻類(lèi)通過(guò)光合作用固定二氧化碳的能力也得到了增強(qiáng)，這體現(xiàn)在所有三種類(lèi)型的NPs均提高了RuBisCo活性（49.19%–68.33%）。研究人員還在自然水體中進(jìn)行了暴露實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，在經(jīng)過(guò)100天的暴露后，nPS和nPS-COOH暴露組的藻類(lèi)細(xì)胞數(shù)量、生物量和Chl a均有所增加，這與在超純水制備的培養(yǎng)基中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。然而，nPS-NH₂暴露組的Chl a增加并不顯著，這可能是由于nPS-NH₂與自然水體中的有機(jī)物結(jié)合，減少了與藻類(lèi)細(xì)胞的接觸。
圖1：藻類(lèi)在長(zhǎng)期適應(yīng)納米塑料（NPs）后的初級(jí)生產(chǎn)力。
（A） 藻類(lèi)在實(shí)驗(yàn)室中適應(yīng)NPs的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)圖。（B-G）藻類(lèi)菌株在實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)期間的（B）葉綠素a（Chl a）含量、（C）藻類(lèi)細(xì)胞數(shù)量、（D）葉綠素a含量、（E）生物量、（F）生物體積、（G）最大相對(duì)電子傳遞速率（rETRmax）。
（H-J）藻類(lèi)在適應(yīng)三種NPs 100天后的（H）RuBisCo活性、（I）藻類(lèi)細(xì)胞數(shù)量、（J）葉綠素a含量。（K） 藻類(lèi)在自然水體培養(yǎng)系統(tǒng)中暴露于三種NPs（100天）后的生物量。
（2）藻類(lèi)初級(jí)生產(chǎn)力的個(gè)體性狀分化
為了進(jìn)一步揭示不同表面電荷的NPs對(duì)藻類(lèi)初級(jí)生產(chǎn)力響應(yīng)的差異，研究人員在個(gè)體水平上評(píng)估了藻類(lèi)的葉綠體數(shù)量。結(jié)果顯示，藻類(lèi)細(xì)胞的平均葉綠體數(shù)量并未受到長(zhǎng)期NPs適應(yīng)的影響。盡管在三種NPs暴露組之間葉綠體體積沒(méi)有顯著差異，但在nPS暴露組中，從均質(zhì)藻類(lèi)群體中出現(xiàn)了兩個(gè)具有低水平（P1）和高水平（P2）葉綠體表達(dá)的亞群。相比之下，nPS-COOH和nPS-NH₂暴露組并未表現(xiàn)出顯著的分化現(xiàn)象。P1亞群（占總細(xì)胞數(shù)的54.92%）的平均信號(hào)強(qiáng)度顯著下降至對(duì)照組的67.65%，而P2亞群（占總細(xì)胞數(shù)的45.08%）則顯著增加至對(duì)照組的131.64%。研究人員使用流式細(xì)胞儀（FACS）從大量藻類(lèi)懸浮液中分選出了P1和P2亞群，分選效率超過(guò)95%。觀察P1和P2亞群的細(xì)胞形態(tài)發(fā)現(xiàn)，P2的生物體積比P1高出1.41倍。這種在nPS暴露下出現(xiàn)的亞群分化現(xiàn)象可能歸因于藻類(lèi)的異質(zhì)性。長(zhǎng)期暴露于NPs的藻類(lèi)與NPs之間的相互作用可能會(huì)觸發(fā)可遺傳的表型多樣性和生理特征的分化。在長(zhǎng)期NPs暴露后，觀察到藻類(lèi)初級(jí)生產(chǎn)力在群體水平上有所提高，而在個(gè)體水平上則表現(xiàn)出明顯的性狀分化，這表明藻類(lèi)基因組在適應(yīng)NPs的過(guò)程中發(fā)生了改變。
圖2：藻類(lèi)在長(zhǎng)期適應(yīng)納米塑料（NPs）后的個(gè)體水平性狀分化。
（A）藻類(lèi)個(gè)體初級(jí)生產(chǎn)力檢測(cè)的示意圖。（B-C）有無(wú)NPs處理的藻類(lèi)細(xì)胞在個(gè)體水平上的分布情況。
（D）P1和P2的代表性圖像及生物體積分布統(tǒng)計(jì)。
（E）P1和P2中藻類(lèi)細(xì)胞的生物體積。
（3）NPs長(zhǎng)期適應(yīng)后藻類(lèi)的全基因組DNA甲基化變化
為全面理解藻類(lèi)初級(jí)生產(chǎn)力的提升，研究人員利用全基因組重亞硫酸鹽測(cè)序（WGBS）技術(shù)，在單堿基分辨率下分析了小球藻在長(zhǎng)期暴露于三種NPs后的DNA甲基化圖譜，并觀察到基因組水平上的變化。在對(duì)照組和暴露組中，藻類(lèi)的甲基化位點(diǎn)數(shù)量在10.62M-19.17M，亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化率高于99%，表明原始數(shù)據(jù)的完整性和可靠性。從平均甲基化率結(jié)果來(lái)看，與對(duì)照組相比，暴露于nPS、nPS-COOH和nPS-NH₂的藻類(lèi)發(fā)生高甲基化。5-甲基胞嘧啶（5mC）的甲基化水平也呈現(xiàn)出類(lèi)似的基因組特征。整體甲基化率從對(duì)照組的0.88%顯著上升至nPS、nPS-COOH和nPS-NH₂暴露組的0.90%、0.89%和0.90%。更多的高甲基化差異甲基化區(qū)域（DMRs）導(dǎo)致甲基化水平增加。5mC主要分布在CG位點(diǎn)（對(duì)照組為0.83%，nPS為0.84%，nPS-COOH為0.83%，nPS-NH₂為0.84%），其次是CHG和CHH位點(diǎn)。與先前的一項(xiàng)研究類(lèi)似，無(wú)論NPs類(lèi)型如何，CG位點(diǎn)的甲基化水平和覆蓋率均高于CHG和CHH。因此，與CHG和CHH相比，CG位點(diǎn)更適合用于分析在長(zhǎng)期NPs暴露下基因組信息的適應(yīng)性變化。鑒于相鄰的甲基化位點(diǎn)通常協(xié)同作用，基因表達(dá)的變化高度依賴于低甲基化和高甲基化DMRs的水平。
圖3：藻類(lèi)在長(zhǎng)期適應(yīng)納米塑料（NPs）后的DNA甲基化變化。
（A）DNA甲基化和基因表達(dá)的示意圖。（B）5mC在功能基因組區(qū)域的相對(duì)密度分布。
（C）藻類(lèi)在有無(wú)NPs處理下的平均甲基化率。
（D）暴露于三種NPs后的差異甲基化區(qū)域（DMRs）的數(shù)量。
（E-G）CG、CHG和CHH的（E）平均甲基化率，（F）甲基化水平，（G）在對(duì)照組中的甲基化深度。
（4）藻類(lèi)DMRs對(duì)NPs的適應(yīng)性變化
研究人員進(jìn)一步通過(guò)比較nPS、nPS-COOH和nPS-NH₂組與對(duì)照組的CG位點(diǎn)檢測(cè)了DMRs。結(jié)果顯示， nPS暴露組有534個(gè)高甲基化DMRs和209個(gè)低甲基化DMRs，nPS-COOH暴露組有497個(gè)高甲基化DMRs和310個(gè)低甲基化DMRs，nPS-NH₂暴露組有660個(gè)高甲基化DMRs和470個(gè)低甲基化DMRs。因此，在暴露于三種類(lèi)型的NPs后，高甲基化DMRs的數(shù)量均多于低甲基化DMRs。研究人員利用高甲基化區(qū)域?yàn)槊總�(gè)基因組scaffold構(gòu)建了甲基化圖譜。DMRs在基因組中的分布顯示出在每個(gè)暴露組的所有支架中均呈現(xiàn)出高甲基化趨勢(shì)。在DMRs的基因組位點(diǎn)（啟動(dòng)子、外顯子、內(nèi)含子、3'UTR和5'UTR）中，位于啟動(dòng)子和外顯子區(qū)域的DMRs數(shù)量多于內(nèi)含子區(qū)域。任何NPs處理均能誘導(dǎo)更多的高甲基化DMRs位于啟動(dòng)子區(qū)域，而在內(nèi)含子區(qū)域則較少。為了闡釋DMRs的功能，研究人員利用啟動(dòng)子相關(guān)DMRs關(guān)聯(lián)基因（DMGs）進(jìn)行了KEGG功能富集分析。分析結(jié)果表明，暴露于NPs后的高甲基化DMRs和低甲基化DMRs均富集在一系列生物代謝過(guò)程（如“光合作用”和“甘油脂代謝”）中，這可能與藻類(lèi)在長(zhǎng)期NPs暴露后初級(jí)生產(chǎn)力的提升有關(guān)。
圖4：差異甲基化區(qū)域（DMRs）的分布與功能。
（A）暴露于三種納米塑料（NPs）后，DMRs在基因組scaffold中的分布情況。（B）DMRs在基因組位點(diǎn)（啟動(dòng)子、外顯子、內(nèi)含子、3'UTR和5'UTR）中的分布情況。
（C）在啟動(dòng)子和genebody區(qū)域鑒定的DMRs的KEGG功能富集分析。
（5）藻類(lèi)長(zhǎng)期適應(yīng)后的轉(zhuǎn)錄組變化
為將藻類(lèi)初級(jí)生產(chǎn)力的全基因組變化與生理變化聯(lián)系起來(lái)，研究人員利用RNA-seq技術(shù)確定了藻類(lèi)在長(zhǎng)期暴露于三種NPs后的轉(zhuǎn)錄組變化。轉(zhuǎn)錄組結(jié)果顯示，nPS-COOH暴露組引起的差異表達(dá)基因（DEGs）數(shù)量顯著多于nPS和nPS-NH₂暴露組。此外研究人員還對(duì)DEGs進(jìn)行注釋?zhuān)⑦M(jìn)行基因集富集分析（GSEA）以研究轉(zhuǎn)錄組變化功能。一系列與氨基酸和肽鏈合成相關(guān)通路（如tRNA生物合成、核糖體和核糖體生物合成）被三種類(lèi)型的NPs抑制，表明所有三種類(lèi)型NPs都能干擾蛋白質(zhì)合成。外泌體通路被所有三種NPs上調(diào)，這一過(guò)程有助于從衰老細(xì)胞中清除ROS、氧化脂質(zhì)和其他有害代謝物，從而重新啟動(dòng)藻類(lèi)增殖。光合作用蛋白通路在nPS-NH₂處理下顯著下調(diào)。這一結(jié)果與DMRs富集結(jié)果一致（圖4C），可能解釋了為什么在nPS-NH₂處理后藻類(lèi)生物量和生物體積沒(méi)有顯著變化（圖1E、F）。
（6）NPs長(zhǎng)期適應(yīng)后基因組變化與基因表達(dá)水平的關(guān)系
研究人員進(jìn)一步分析了甲基化組和轉(zhuǎn)錄組的結(jié)果，以揭示藻類(lèi)在長(zhǎng)期NPs暴露下受到影響的分子機(jī)制。DMGs和DEGs的整合分析結(jié)果揭示了nPS-COOH的DEGs數(shù)量多于其他兩組，因此在nPS-COOH暴露組中鑒定出的候選基因最多（69個(gè)）。本研究通過(guò)啟動(dòng)子相關(guān)DMRs關(guān)聯(lián)基因（PDMGs）與DEGs篩選出的候選基因富集于一系列通路，如蛋白質(zhì)代謝過(guò)程、蛋白水解和含氮有機(jī)化合物代謝過(guò)程。相比之下，通過(guò)genebody（基因體）相關(guān)DMRs關(guān)聯(lián)基因（GDMGs）與DEGs篩選出的候選基因富集于催化活性的正向調(diào)控、分子功能和水解酶活性等通路。這一結(jié)果表明碳和氮的代謝受啟動(dòng)子區(qū)域甲基化調(diào)控。這些通路的調(diào)控可能代表了藻類(lèi)對(duì)長(zhǎng)期NPs暴露的適應(yīng)性響應(yīng)，并進(jìn)一步影響下游功能。基因表達(dá)與DNA甲基化之間的Pearson相關(guān)性分析結(jié)果表明，PDMGs在nPS和nPS-NH₂暴露組中與DEGs呈負(fù)相關(guān)，在nPS-COOH暴露組中則呈正相關(guān)。而GDMGs在nPS和nPS-NH₂暴露組中與DEGs呈正相關(guān)，但在nPS-COOH暴露下則呈負(fù)相關(guān)。先前研究已經(jīng)表明，啟動(dòng)子區(qū)域高甲基化和基因體區(qū)域的低甲基化會(huì)抑制目標(biāo)基因表達(dá)，而啟動(dòng)子區(qū)域低甲基化和基因體區(qū)域高甲基化則會(huì)促進(jìn)目標(biāo)基因表達(dá)。nPS和nPS-NH₂暴露組中DMRs和DEGs的相關(guān)性與先前的研究結(jié)果一致，但nPS-COOH暴露組的相關(guān)性則與先前研究結(jié)果相反。DNA甲基化對(duì)轉(zhuǎn)錄調(diào)控的負(fù)調(diào)控方向表明，nPS-COOH可能會(huì)導(dǎo)致藻類(lèi)基因轉(zhuǎn)錄沉默，而nPS和nPS-NH₂則不會(huì)。這表明在長(zhǎng)期暴露于不同電荷的NPs后，藻類(lèi)在基因組水平上的適應(yīng)策略存在差異。
圖5：長(zhǎng)期NP適應(yīng)后基因組變化與基因表達(dá)水平的整合分析結(jié)果。
(A) 下調(diào)的差異表達(dá)基因（DEGs）與啟動(dòng)子相關(guān)高甲基化差異甲基化區(qū)域（DMRs）關(guān)聯(lián)基因（PDMGs）。(B) 下調(diào)的DEGs與基因體相關(guān)低甲基化DMRs關(guān)聯(lián)基因（GDMGs）。
(C) 上調(diào)的DEGs與低甲基化PDMRs。
(D) 上調(diào)的DEGs與高甲基化GDMRs。
(E) 對(duì)于(A)和(C)中的候選基因進(jìn)行GO功能富集分析；
(F) 對(duì)于(B)和(D)中的候選基因進(jìn)行GO功能富集分析；
(G) 暴露于三種NPs后，每個(gè)基因的基因表達(dá)與DNA甲基化之間的Pearson相關(guān)性分析。
討論和啟示
與短期高濃度暴露相比，長(zhǎng)期低濃度暴露更能反映納米塑料在環(huán)境中的真實(shí)影響。DNA甲基化作為一種表觀遺傳修飾，可能通過(guò)調(diào)控基因表達(dá)幫助藻類(lèi)適應(yīng)納米塑料的長(zhǎng)期暴露。納米塑料可能通過(guò)增強(qiáng)藻類(lèi)初級(jí)生產(chǎn)力，影響水生生態(tài)系統(tǒng)的碳循環(huán)和能量傳遞。本研究結(jié)果提示，納米塑料的生態(tài)毒理學(xué)評(píng)估需要考慮長(zhǎng)期低濃度暴露的影響。
WGBS和RNA-seq技術(shù)為揭示藻類(lèi)對(duì)納米塑料的適應(yīng)性機(jī)制提供了重要工具
WGBS：通過(guò)全基因組重亞硫酸鹽測(cè)序，研究揭示了藻類(lèi)在納米塑料長(zhǎng)期暴露下的DNA甲基化變化，為理解藻類(lèi)的表觀遺傳適應(yīng)機(jī)制提供重要數(shù)據(jù)。
RNA-seq：通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序研究分析藻類(lèi)基因表達(dá)的變化，揭示納米塑料對(duì)藻類(lèi)生理功能的影響。
整合分析：WGBS和RNA-seq技術(shù)的關(guān)聯(lián)分析，從基因組和轉(zhuǎn)錄組兩個(gè)層面全面解析藻類(lèi)對(duì)納米塑料的適應(yīng)性機(jī)制，為環(huán)境應(yīng)激下的生物適應(yīng)性研究提供了新的方法和理論基礎(chǔ)。
參考文獻(xiàn)：
Liu S, Huang X, Han J, Yao L, Li H, Xin G, Ho SH, Zhao J, Xing B. Genome-Wide Molecular Adaptation in Algal Primary Productivity Induced by Prolonged Exposure to Environmentally Realistic Concentration of Nanoplastics. ACS Nano. 2024 Oct 19. doi: 10.1021/acsnano.4c09709.
標(biāo)簽：
DNA甲基化
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