引言反相HPLC已成為分離和分析蛋白質和多肽的重要工具。
它在生物技術行業中被廣泛應用于蛋白質類治療產品的表征，以及這些產品和雜質的鑒定。
在通過質譜鑒定蛋白質之前，反相HPLC在從消化后的蛋白質組中分離多肽方面有著至關重要的作用。
它也被用于探索性研究中多種蛋白質和多肽的純化，以及蛋白類治療藥物的大規模純化。


反相HPLC靈敏、通用性強，還可與質譜等技術結合使用，在蛋白質研究中具有重要的地位。
此外，它還能夠分離結構近乎相同的蛋白質，因而得到了廣泛的應用。
正如牛、人和豬胰島素變異體的分離過程所示（圖1），反相HPLC能夠分離非常相似的蛋白質。
牛胰島素和人胰島素僅有三個氨基酸的差別，也能夠被完全分離開來。
牛胰島素在胰島素“a”鏈的第8位為丙氨酸，第10位為纈氨酸，“b”鏈的第30位為丙氨酸。
而人胰島素在胰島素“a”鏈的第8位為蘇氨酸，第10位為異亮氨酸，“b”鏈的第30位為蘇氨酸。


圖1. 以RP-HPLC對緊密關聯的胰島素變異體進行分離

條件 色譜柱：ACE 5 C18,4.6 x 250mm 洗脫液：含有29.3 - 31.7% 乙腈的 0.1% 三氟乙酸溶液，以1.0毫升/分鐘的速率洗脫至少16分鐘 樣品：牛、人和豬胰島素

 
豬胰島素和人胰島素僅有一個氨基酸的差異（豬胰島素的“b”鏈第30位為丙氨酸，人胰島素該位置為蘇氨酸），在基線即已分離。
在另一個實例中，盡管兔胰島素和人胰島素僅有一個氨基酸的差異，即以蘇氨酸取代了絲氨酸，但也同樣得到了分離（參考文獻1）。


反相HPLC的高分離能力也被擴展應用到了多肽上。
在圖2中，兩種多肽盡管只有一個氨基酸的差異，即絲氨酸對蘇氨酸，但也得到了完全的分離。
這種高分離能力是反相HPLC在蛋白質和多肽分離中得到廣泛應用的基礎性因素。
 
圖2. 以RP-HPLC對緊密關聯的多肽進行分離。僅有一個氨基酸不同的兩種十肽菌素，一種含絲氨酸，而另一種含蘇氨酸。

條件 色譜柱：C18 寬孔柱， 4.6 x 250 毫米 洗脫液： A. 含有0.1%三氟乙酸的水溶液 B. 含有0.08%三氟乙酸的乙腈溶液 梯度：0 - 35%的B溶液超過73分鐘（參考文獻2）

蛋白質/多肽的保留機制
在反相HPLC中，顆粒表面是十分疏水的，因為其表面通過化學連接有羥基（圖3中的波浪形紅線）。
通過疏水表面對蛋白質一面（被稱為“疏水性足”）的吸附，蛋白質被保留下來（圖3）。
與疏水表面的厚度相比，蛋白質要大得多，因此蛋白質僅有一部分被疏水表面所吸附。
大部分蛋白質位于表面上方并與流動相接觸。
由這種疏水性吸附所導致的凈相互作用非常強，會導致蛋白質保持吸附在表面上（圖4A），直至接觸到特定濃度的有機溶劑，這時蛋白質會從表面上解吸附并從色譜柱上洗脫（圖4B）。
在最初的吸附/解吸附之后，盡管蛋白質在從色譜柱上移動下來時仍會與表面產生一些相互作用，但卻是十分微弱的，對分離過程無影響。
分離是由單次吸附/解吸附過程完成的。
解吸蛋白質所需要的有機改性劑的濃度十分精確，并與疏水足的大小呈函數關系。
詳情請參閱參考文獻3。


圖4. 進入色譜柱的蛋白質被吸附在柱頂端附近的疏水表面上（A）并且一直保持吸附，直至有機改性劑的濃度達到特定值，此時蛋白質從表面解吸附（B）。



在反相HPLC中，吸附/解吸保留機制導致蛋白質的保留行為與小分子不同。
小分子的保留行為隨著有機溶劑濃度的改變而緩慢改變時（圖5，聯苯），一旦有機溶劑的濃度達到所需要的值，蛋白質的保留行為即發生突然改變，引起保留時間的快速變化（圖5，蛋白質）。
該過程產生的尖銳峰形常見于蛋白質和多肽（圖6A）。
由于有機溶劑濃度的微小變化會引起的顯著的保留行為變化，等度洗脫很少被用于蛋白質中，因為峰變寬了，而有機溶劑的微小改變會導致蛋白質保留行為的巨大變化（圖6B）。

圖5.有機溶劑濃度對應的保留行為



圖6.
A. 梯度洗脫過程中多肽和蛋白質洗脫出尖銳峰形。
B. 等度洗脫下，蛋白質的峰形（本例中為溶菌酶）很寬，有機溶劑的微小改變都會引起保留時間的巨大變化。