ELISA實(shí)驗(yàn)標(biāo)本保存技術(shù)解讀
ELISA酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)免疫分析是一種利用特定抗體與抗原或半抗原發(fā)生的高選擇性高特異性識(shí)別和結(jié)合原理，對(duì)待測(cè)抗體或者抗原進(jìn)行分析測(cè)定的方法，酶聯(lián)免疫吸附分析（下稱ELISA）是免疫分析的一種，分三個(gè)部分組成：免疫識(shí)別，信號(hào)輸出和數(shù)據(jù)處理。在進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)時(shí)，保存標(biāo)本是確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性的關(guān)鍵步驟。以下是一些關(guān)于如何保存ELISA實(shí)驗(yàn)標(biāo)本的建議：
1. 短期保存：如果標(biāo)本在一周內(nèi)需要進(jìn)行檢測(cè)，可以將它們保存在2-8°C的環(huán)境中。這個(gè)溫度范圍可以抑制微生物生長，同時(shí)保持標(biāo)本的穩(wěn)定性。
2. 長期保存：對(duì)于需要保存超過一周的標(biāo)本，應(yīng)根據(jù)保存時(shí)間和預(yù)期使用的抗原或抗體穩(wěn)定性選擇合適的保存溫度。例如：
-20°C：適用于短期內(nèi)保存（大約1個(gè)月），但要注意避免反復(fù)凍融，因?yàn)檫@可能影響蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。
-80°C：對(duì)于需要長期保存（6個(gè)月或更長時(shí)間）的標(biāo)本，建議使用-80°C的冷凍條件。這也減少了反復(fù)凍融對(duì)樣本的影響。
3. 分裝凍存：為了減少每次實(shí)驗(yàn)時(shí)的取樣誤差，以及避免樣本的浪費(fèi)，建議將標(biāo)本按一次實(shí)驗(yàn)所需的量分裝保存。這樣可以確保每次實(shí)驗(yàn)使用新鮮的樣本，減少因反復(fù)凍融導(dǎo)致的蛋白效價(jià)下降。
4. 避免溶血：在采集血清或血漿時(shí)，應(yīng)避免溶血，因?yàn)榧t細(xì)胞破裂會(huì)釋放具有過氧化物酶活性的物質(zhì)，可能增加非特異性顯色，影響ELISA的結(jié)果。
5. 抗凝劑的選擇：對(duì)于血漿樣本，選擇合適的抗凝劑非常重要。常用的抗凝劑包括EDTA、肝素和枸櫞酸鈉�？鼓齽┑倪x擇應(yīng)根據(jù)待檢測(cè)物質(zhì)的性質(zhì)和實(shí)驗(yàn)要求來決定。
6. 樣本穩(wěn)定性：在保存標(biāo)本時(shí)，還應(yīng)考慮待檢測(cè)物質(zhì)的穩(wěn)定性。某些物質(zhì)在特定條件下可能不穩(wěn)定，需要添加保護(hù)劑或在特定條件下保存。
7. 尿液樣本：尿液樣本應(yīng)正確收集并立即處理，避免污染。如果不能立即檢測(cè)，應(yīng)盡快離心去除細(xì)胞和沉淀，并在適當(dāng)?shù)臏囟认卤４妗?br />
8. 細(xì)胞和組織樣本：細(xì)胞和組織樣本在處理后應(yīng)立即進(jìn)行勻漿或裂解，并在低溫下快速離心收集上清。細(xì)胞裂解液可能需要在-80°C保存，并避免反復(fù)凍融。
9. 避免污染：在處理和保存標(biāo)本時(shí)，應(yīng)嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作，避免微生物污染，因?yàn)槲廴究赡軐?dǎo)致假陽性結(jié)果。
10. 文獻(xiàn)預(yù)實(shí)驗(yàn)：在保存和處理標(biāo)本之前，建議查閱相關(guān)文獻(xiàn)并進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，以確定待檢測(cè)物質(zhì)的最佳保存條件和稀釋比例。
通過遵循這些保存和處理標(biāo)本的建議，可以最大限度地保證ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。
ELISA實(shí)驗(yàn)在標(biāo)本保存時(shí)常出現(xiàn)溶血、凝集不全、受細(xì)菌污染等現(xiàn)象發(fā)生，下面詳述應(yīng)對(duì)策略:
一、標(biāo)本保存不當(dāng)
在冰箱中保存過久的標(biāo)本，血清中IgG可聚合成多聚體、AFP可形成二聚體，在間接法ELISA測(cè)定中會(huì)導(dǎo)致本底過深、甚至造成假陽性；標(biāo)本放置時(shí)間過長（如一天以上），有時(shí)抗原或抗體免疫活性減弱，亦可出現(xiàn)假陰性。為克服上述干擾，ELISA測(cè)定的血清標(biāo)本宜為新鮮采集；如不能立即測(cè)定，5天內(nèi)測(cè)定的血清標(biāo)本可存放于4℃，1周后測(cè)定的血清標(biāo)本應(yīng)低溫凍存；凍存后融解的標(biāo)本，蛋白質(zhì)局部濃縮，分布不均，應(yīng)充分混合后再測(cè)定，但混勻時(shí)應(yīng)輕柔，不可強(qiáng)烈振蕩。
二、標(biāo)本溶血
由于各種人為原因引起的標(biāo)本溶血，均可因紅細(xì)胞破壞溶解時(shí)釋放出大量具有過氧化物酶活性的血紅蛋白，在以辣根過氧化物酶為標(biāo)記的ELISA測(cè)定中，會(huì)導(dǎo)致非特異性顯色，ELISA試劑盒干擾測(cè)定結(jié)果。為克服上述干擾作用，標(biāo)本采集時(shí)必須注意避免溶血。
三、標(biāo)本凝集不全
在沒有促凝劑和抗凝劑存在的情況下，正常血液采集后1/2~2h開始凝固，18~24h完全凝固。臨床檢驗(yàn)工作中，有時(shí)為了爭取時(shí)間快速檢測(cè)，常在血液還未開始凝固時(shí)即強(qiáng)行離心分離血清，此時(shí)的血清中仍殘留部分纖維蛋白原，在ELISA測(cè)定過程中可以形成肉眼可見的纖維蛋白塊，易造成假陽性結(jié)果；這類情況于次日復(fù)查時(shí)因血凝已完全，血清中不再有纖維蛋白原存在，故復(fù)查結(jié)果變?yōu)殛幮浴楸苊馍鲜龈蓴_作用，解決的辦法最好是血液標(biāo)本采集后必須使其充分凝固后再分離血清，或標(biāo)本采集時(shí)用帶分離膠的采血管或于采血管中加入適當(dāng)?shù)拇倌齽?br />
四、標(biāo)本管中添加物質(zhì)的影響
抗凝劑、酶抑制劑及快速分離血清的分離膠等均對(duì)ELISA測(cè)定有一定干擾作用。
五、標(biāo)本受細(xì)菌污染
因菌體中可能含有內(nèi)源性辣根過氧化物酶，因此，被細(xì)菌污染的標(biāo)本同溶血標(biāo)本一樣，亦可產(chǎn)生非特異性顯色而干擾測(cè)定結(jié)果。
做好了ELISA試劑盒因素和操作因素之后，確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性就容易的多了。
1. 短期保存：如果標(biāo)本在一周內(nèi)需要進(jìn)行檢測(cè)，可以將它們保存在2-8°C的環(huán)境中。這個(gè)溫度范圍可以抑制微生物生長，同時(shí)保持標(biāo)本的穩(wěn)定性。
2. 長期保存：對(duì)于需要保存超過一周的標(biāo)本，應(yīng)根據(jù)保存時(shí)間和預(yù)期使用的抗原或抗體穩(wěn)定性選擇合適的保存溫度。例如：
-20°C：適用于短期內(nèi)保存（大約1個(gè)月），但要注意避免反復(fù)凍融，因?yàn)檫@可能影響蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。
-80°C：對(duì)于需要長期保存（6個(gè)月或更長時(shí)間）的標(biāo)本，建議使用-80°C的冷凍條件。這也減少了反復(fù)凍融對(duì)樣本的影響。
3. 分裝凍存：為了減少每次實(shí)驗(yàn)時(shí)的取樣誤差，以及避免樣本的浪費(fèi)，建議將標(biāo)本按一次實(shí)驗(yàn)所需的量分裝保存。這樣可以確保每次實(shí)驗(yàn)使用新鮮的樣本，減少因反復(fù)凍融導(dǎo)致的蛋白效價(jià)下降。
4. 避免溶血：在采集血清或血漿時(shí)，應(yīng)避免溶血，因?yàn)榧t細(xì)胞破裂會(huì)釋放具有過氧化物酶活性的物質(zhì)，可能增加非特異性顯色，影響ELISA的結(jié)果。
5. 抗凝劑的選擇：對(duì)于血漿樣本，選擇合適的抗凝劑非常重要。常用的抗凝劑包括EDTA、肝素和枸櫞酸鈉�？鼓齽┑倪x擇應(yīng)根據(jù)待檢測(cè)物質(zhì)的性質(zhì)和實(shí)驗(yàn)要求來決定。
6. 樣本穩(wěn)定性：在保存標(biāo)本時(shí)，還應(yīng)考慮待檢測(cè)物質(zhì)的穩(wěn)定性。某些物質(zhì)在特定條件下可能不穩(wěn)定，需要添加保護(hù)劑或在特定條件下保存。
7. 尿液樣本：尿液樣本應(yīng)正確收集并立即處理，避免污染。如果不能立即檢測(cè)，應(yīng)盡快離心去除細(xì)胞和沉淀，并在適當(dāng)?shù)臏囟认卤４妗?br />
8. 細(xì)胞和組織樣本：細(xì)胞和組織樣本在處理后應(yīng)立即進(jìn)行勻漿或裂解，并在低溫下快速離心收集上清。細(xì)胞裂解液可能需要在-80°C保存，并避免反復(fù)凍融。
9. 避免污染：在處理和保存標(biāo)本時(shí)，應(yīng)嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作，避免微生物污染，因?yàn)槲廴究赡軐?dǎo)致假陽性結(jié)果。
10. 文獻(xiàn)預(yù)實(shí)驗(yàn)：在保存和處理標(biāo)本之前，建議查閱相關(guān)文獻(xiàn)并進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，以確定待檢測(cè)物質(zhì)的最佳保存條件和稀釋比例。
通過遵循這些保存和處理標(biāo)本的建議，可以最大限度地保證ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。
ELISA實(shí)驗(yàn)在標(biāo)本保存時(shí)常出現(xiàn)溶血、凝集不全、受細(xì)菌污染等現(xiàn)象發(fā)生，下面詳述應(yīng)對(duì)策略:
一、標(biāo)本保存不當(dāng)
在冰箱中保存過久的標(biāo)本，血清中IgG可聚合成多聚體、AFP可形成二聚體，在間接法ELISA測(cè)定中會(huì)導(dǎo)致本底過深、甚至造成假陽性；標(biāo)本放置時(shí)間過長（如一天以上），有時(shí)抗原或抗體免疫活性減弱，亦可出現(xiàn)假陰性。為克服上述干擾，ELISA測(cè)定的血清標(biāo)本宜為新鮮采集；如不能立即測(cè)定，5天內(nèi)測(cè)定的血清標(biāo)本可存放于4℃，1周后測(cè)定的血清標(biāo)本應(yīng)低溫凍存；凍存后融解的標(biāo)本，蛋白質(zhì)局部濃縮，分布不均，應(yīng)充分混合后再測(cè)定，但混勻時(shí)應(yīng)輕柔，不可強(qiáng)烈振蕩。
二、標(biāo)本溶血
由于各種人為原因引起的標(biāo)本溶血，均可因紅細(xì)胞破壞溶解時(shí)釋放出大量具有過氧化物酶活性的血紅蛋白，在以辣根過氧化物酶為標(biāo)記的ELISA測(cè)定中，會(huì)導(dǎo)致非特異性顯色，ELISA試劑盒干擾測(cè)定結(jié)果。為克服上述干擾作用，標(biāo)本采集時(shí)必須注意避免溶血。
三、標(biāo)本凝集不全
在沒有促凝劑和抗凝劑存在的情況下，正常血液采集后1/2~2h開始凝固，18~24h完全凝固。臨床檢驗(yàn)工作中，有時(shí)為了爭取時(shí)間快速檢測(cè)，常在血液還未開始凝固時(shí)即強(qiáng)行離心分離血清，此時(shí)的血清中仍殘留部分纖維蛋白原，在ELISA測(cè)定過程中可以形成肉眼可見的纖維蛋白塊，易造成假陽性結(jié)果；這類情況于次日復(fù)查時(shí)因血凝已完全，血清中不再有纖維蛋白原存在，故復(fù)查結(jié)果變?yōu)殛幮浴楸苊馍鲜龈蓴_作用，解決的辦法最好是血液標(biāo)本采集后必須使其充分凝固后再分離血清，或標(biāo)本采集時(shí)用帶分離膠的采血管或于采血管中加入適當(dāng)?shù)拇倌齽?br />
四、標(biāo)本管中添加物質(zhì)的影響
抗凝劑、酶抑制劑及快速分離血清的分離膠等均對(duì)ELISA測(cè)定有一定干擾作用。
五、標(biāo)本受細(xì)菌污染
因菌體中可能含有內(nèi)源性辣根過氧化物酶，因此，被細(xì)菌污染的標(biāo)本同溶血標(biāo)本一樣，亦可產(chǎn)生非特異性顯色而干擾測(cè)定結(jié)果。
做好了ELISA試劑盒因素和操作因素之后，確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性就容易的多了。
Copyright(C) 1998-2025 生物器材網(wǎng) 電話：021-64166852;13621656896 E-mail：info@bio-equip.com