非靶代謝組學(xué)在研究慢性腎臟病的發(fā)病機(jī)制與可能治療靶點(diǎn)中的應(yīng)用
百趣代謝組學(xué)資訊:慢性腎病的延緩方法有了！
文章標(biāo)題：Metabolomics analysis of human plasma reveals decreased production of trimethylamine N-oxide retards the progression of chronic kidney disease
發(fā)表期刊：British Journal of Pharmacology
發(fā)表時(shí)間：2022.1
影響因子：8.739
合作客戶(hù)：上海市第十人民醫(yī)院、重慶醫(yī)科大學(xué)
百趣生物提供服務(wù)：非靶代謝組學(xué)
研究背景
慢性腎臟病（CKD）是一個(gè)全球性的公共衛(wèi)生問(wèn)題，也是導(dǎo)致死亡的主要原因之一。然而，CKD的發(fā)病機(jī)制和干預(yù)方法尚不完全清楚。因此，一些創(chuàng)新的組學(xué)技術(shù)被用來(lái)研究CKD的發(fā)病機(jī)制和可能的治療靶點(diǎn)，包括蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)，以減緩CKD的進(jìn)展。
結(jié)果和討論
01人血漿的代謝組學(xué)分析揭示了健康組和尿毒癥患者的潛在標(biāo)志物（PM）
由30名尿毒癥患者和30名健康組組成，進(jìn)行代謝組學(xué)分析。為了檢驗(yàn)數(shù)據(jù)的質(zhì)量，我們首先分析了肌酐質(zhì)量強(qiáng)度（Cr）與臨床試驗(yàn)中肌酐血漿濃度之間的相關(guān)性。如圖1a、b所示，在陽(yáng)性模式（圖1a）和陰性模式（圖1b）中，肌酐強(qiáng)度的對(duì)數(shù)值與血漿肌酐的對(duì)數(shù)水平呈良好的線(xiàn)性相關(guān)（兩種模式中的R值均大于0.9）。
圖1. 基于LC-MS/MS的非靶向代謝組學(xué)數(shù)據(jù)的質(zhì)量評(píng)估
所有組中大多數(shù)代謝物的偏差均小于標(biāo)準(zhǔn)偏差的三倍。然而，在所有組中，所有處于正模式和負(fù)模式的代謝物的偏差均低于標(biāo)準(zhǔn)偏差的六倍。因此，對(duì)樣本和質(zhì)量控制進(jìn)行無(wú)監(jiān)督主成分分析。然后，對(duì)處理后的數(shù)據(jù)進(jìn)行監(jiān)督正交偏最小二乘判別分析。用二維得分圖建立一個(gè)預(yù)測(cè)成分和一個(gè)正交成分模型，使用方法中描述的標(biāo)準(zhǔn)，確定了18個(gè)潛在標(biāo)記物（表3），其中尿毒癥患者血漿中只有一個(gè)潛在標(biāo)記物減少。表中也顯示了這些潛在標(biāo)記。
02、潛在標(biāo)志物的相關(guān)分析確定TMAO是與CKD進(jìn)展相關(guān)的標(biāo)志物
對(duì)代謝組學(xué)潛在標(biāo)記物進(jìn)行定量驗(yàn)證，N-乙酰丙氨酸、D-山梨醇和L-焦谷氨酸被排除在進(jìn)一步的分析之外。為了確定CKD進(jìn)展最有希望的標(biāo)志物，我們對(duì)潛在標(biāo)志物的血漿水平與血漿肌酐和eGFR進(jìn)行了相關(guān)分析。與血漿肌酐呈正相關(guān)，與eGFR呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)大于0.79（表4）。此外，血漿TMAO與血漿肌酐和eGFR的回歸分析表明，血漿TMAO與肌酐和eGFR密切相關(guān)，相關(guān)系數(shù)均大于0.8（圖3）。
圖2. 血漿TMAO水平與血漿肌酐TMAO水平相關(guān)性圖（n=195）
03、TMAO抑制細(xì)胞活性并上調(diào)纖維化相關(guān)蛋白
為了測(cè)試TMAO對(duì)腎臟的影響，我們首先測(cè)試了TMAO對(duì)HK-2細(xì)胞的影響。用TMAO處理細(xì)胞24小時(shí)后，細(xì)胞活力略有改變（圖4A）。然而，當(dāng)TMAO濃度小于1.5μM時(shí)，將細(xì)胞與TMAO孵育48小時(shí)可顯著降低細(xì)胞活力，且呈劑量相關(guān)。當(dāng)TMAO濃度大于1.5μM時(shí)，細(xì)胞活力似乎達(dá)到一個(gè)等級(jí)（圖4B）。此外，用TMAO處理細(xì)胞48小時(shí)后，α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）的蛋白表達(dá)明顯增加（圖4C,d），而TGF-β、III型膠原（COL3A1）和纖維連接蛋白的蛋白水平僅略有改變。
圖3. TMAO通過(guò)促進(jìn)腎纖維化在體外和小鼠體內(nèi)引起腎損傷
04、TMAO在體內(nèi)引起腎損傷并上調(diào)纖維化相關(guān)蛋白
給小鼠喂食TMAO后，其體重略有變化，但在視覺(jué)上顯著降低了腎臟重量（圖4f,g）和腎臟與體重的比率（圖4h）。相比之下，兩組小鼠的心臟質(zhì)量和心體質(zhì)量比均無(wú)顯著變化。給小鼠喂食TMAO可顯著提高TMAO（圖4i）和肌酐（圖4j）的血漿水平。此外，給小鼠提供TMAO可增加α-Sma蛋白的腎臟表達(dá)（圖4K,l）。
圖4. TMAO通過(guò)促進(jìn)腎纖維化在體外和小鼠體內(nèi)引起腎損傷。
05、抑制TMAO生成減輕腺嘌呤誘導(dǎo)的體內(nèi)腎損傷
治療前，四組小鼠的體重略有不同。與對(duì)照飲食相比，ARD飲食的消耗量顯著減少。用ARD喂養(yǎng)小鼠可顯著降低小鼠體重（圖5A）和腎臟重量（圖4B）。用抗生素雞尾酒（ABX）治療小鼠可減輕ARD誘導(dǎo)的小鼠體重減輕（圖5A）。DMB或ABX治療可減輕ARD引起的腎重量減少（圖5b）。ARD喂養(yǎng)顯著提高了血漿TMAO水平，而ABX或DMB處理顯著降低了血漿TMAO水平（圖5c）。正如預(yù)期的那樣，ARD喂養(yǎng)顯著提高了血漿肌酐水平，ABX或DMB治療顯著阻斷了這一效應(yīng)（圖5d）。此外，ARD喂養(yǎng)增加了α-Sma的蛋白表達(dá)，而ABX或DMB處理會(huì)減弱α-Sma的表達(dá)（圖5e,f）。相比之下，ABX或DMB治療均未顯著逆轉(zhuǎn)ARD誘導(dǎo)的心臟質(zhì)量下降。
圖5. TMAO是減緩小鼠模型腎功能不全的治療靶點(diǎn)
組織學(xué)分析表明，ARD給藥導(dǎo)致視覺(jué)腎纖維化（圖6b,fand S4B），而DMB（圖6c）或ABX治療（圖6d）緩解ARD誘導(dǎo)的腎纖維化。圖6e和圖6j總結(jié)了半定量結(jié)果。此外，在偏振光顯微鏡下觀察接受ARD的小鼠腎組織的天狼星紅染色導(dǎo)致弱折射和淺紅色，表明本研究中主要的膠原沉積可能是II型膠原。
圖6. 用3,3-二甲基1-丁醇（DMB）或抗生素混合物（ABX）治療可減輕富含腺嘌呤的飲食（ARD）誘導(dǎo)的腎纖維化
結(jié)論
在第一隊(duì)列中發(fā)現(xiàn)的18個(gè)潛在標(biāo)記物中，氧化三甲胺（TMAO）被確定為一個(gè)有希望的標(biāo)記物，并且它與第二隊(duì)列中CKD患者的腎功能最佳相關(guān)。TMAO處理HK-2細(xì)胞后，細(xì)胞活力降低，α-平滑肌肌動(dòng)蛋白表達(dá)上調(diào)。在小鼠中，含有TMAO的飲食減少了腎臟重量，增加了α-平滑肌肌動(dòng)蛋白的蛋白表達(dá)。此外，通過(guò)使用3,3-二甲基-1-丁醇抑制TMAO的生物合成途徑或使用抗生素混合物破壞腸道微生物群功能來(lái)控制TMAO的產(chǎn)生，可以減輕CKD小鼠模型的腎損傷。結(jié)論和意義：本次研究數(shù)據(jù)表明，減少TMAO的產(chǎn)生可能是一種新的策略，可以減輕CKD腎損傷的進(jìn)展。
文/阿趣代謝組學(xué)
文章標(biāo)題：Metabolomics analysis of human plasma reveals decreased production of trimethylamine N-oxide retards the progression of chronic kidney disease
發(fā)表期刊：British Journal of Pharmacology
發(fā)表時(shí)間：2022.1
影響因子：8.739
合作客戶(hù)：上海市第十人民醫(yī)院、重慶醫(yī)科大學(xué)
百趣生物提供服務(wù)：非靶代謝組學(xué)
研究背景
慢性腎臟病（CKD）是一個(gè)全球性的公共衛(wèi)生問(wèn)題，也是導(dǎo)致死亡的主要原因之一。然而，CKD的發(fā)病機(jī)制和干預(yù)方法尚不完全清楚。因此，一些創(chuàng)新的組學(xué)技術(shù)被用來(lái)研究CKD的發(fā)病機(jī)制和可能的治療靶點(diǎn)，包括蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)，以減緩CKD的進(jìn)展。
結(jié)果和討論
01人血漿的代謝組學(xué)分析揭示了健康組和尿毒癥患者的潛在標(biāo)志物（PM）
由30名尿毒癥患者和30名健康組組成，進(jìn)行代謝組學(xué)分析。為了檢驗(yàn)數(shù)據(jù)的質(zhì)量，我們首先分析了肌酐質(zhì)量強(qiáng)度（Cr）與臨床試驗(yàn)中肌酐血漿濃度之間的相關(guān)性。如圖1a、b所示，在陽(yáng)性模式（圖1a）和陰性模式（圖1b）中，肌酐強(qiáng)度的對(duì)數(shù)值與血漿肌酐的對(duì)數(shù)水平呈良好的線(xiàn)性相關(guān)（兩種模式中的R值均大于0.9）。
圖1. 基于LC-MS/MS的非靶向代謝組學(xué)數(shù)據(jù)的質(zhì)量評(píng)估表3. 健康對(duì)照組和CKD患者不同階段潛在代謝組學(xué)標(biāo)志物的血漿濃度
對(duì)代謝組學(xué)潛在標(biāo)記物進(jìn)行定量驗(yàn)證，N-乙酰丙氨酸、D-山梨醇和L-焦谷氨酸被排除在進(jìn)一步的分析之外。為了確定CKD進(jìn)展最有希望的標(biāo)志物，我們對(duì)潛在標(biāo)志物的血漿水平與血漿肌酐和eGFR進(jìn)行了相關(guān)分析。與血漿肌酐呈正相關(guān)，與eGFR呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)大于0.79（表4）。此外，血漿TMAO與血漿肌酐和eGFR的回歸分析表明，血漿TMAO與肌酐和eGFR密切相關(guān)，相關(guān)系數(shù)均大于0.8（圖3）。
表4. 血漿電位標(biāo)志物與血漿Cr和eGFR的相關(guān)性
圖2. 血漿TMAO水平與血漿肌酐TMAO水平相關(guān)性圖（n=195）為了測(cè)試TMAO對(duì)腎臟的影響，我們首先測(cè)試了TMAO對(duì)HK-2細(xì)胞的影響。用TMAO處理細(xì)胞24小時(shí)后，細(xì)胞活力略有改變（圖4A）。然而，當(dāng)TMAO濃度小于1.5μM時(shí)，將細(xì)胞與TMAO孵育48小時(shí)可顯著降低細(xì)胞活力，且呈劑量相關(guān)。當(dāng)TMAO濃度大于1.5μM時(shí)，細(xì)胞活力似乎達(dá)到一個(gè)等級(jí)（圖4B）。此外，用TMAO處理細(xì)胞48小時(shí)后，α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）的蛋白表達(dá)明顯增加（圖4C,d），而TGF-β、III型膠原（COL3A1）和纖維連接蛋白的蛋白水平僅略有改變。
圖3. TMAO通過(guò)促進(jìn)腎纖維化在體外和小鼠體內(nèi)引起腎損傷給小鼠喂食TMAO后，其體重略有變化，但在視覺(jué)上顯著降低了腎臟重量（圖4f,g）和腎臟與體重的比率（圖4h）。相比之下，兩組小鼠的心臟質(zhì)量和心體質(zhì)量比均無(wú)顯著變化。給小鼠喂食TMAO可顯著提高TMAO（圖4i）和肌酐（圖4j）的血漿水平。此外，給小鼠提供TMAO可增加α-Sma蛋白的腎臟表達(dá)（圖4K,l）。
圖4. TMAO通過(guò)促進(jìn)腎纖維化在體外和小鼠體內(nèi)引起腎損傷。治療前，四組小鼠的體重略有不同。與對(duì)照飲食相比，ARD飲食的消耗量顯著減少。用ARD喂養(yǎng)小鼠可顯著降低小鼠體重（圖5A）和腎臟重量（圖4B）。用抗生素雞尾酒（ABX）治療小鼠可減輕ARD誘導(dǎo)的小鼠體重減輕（圖5A）。DMB或ABX治療可減輕ARD引起的腎重量減少（圖5b）。ARD喂養(yǎng)顯著提高了血漿TMAO水平，而ABX或DMB處理顯著降低了血漿TMAO水平（圖5c）。正如預(yù)期的那樣，ARD喂養(yǎng)顯著提高了血漿肌酐水平，ABX或DMB治療顯著阻斷了這一效應(yīng)（圖5d）。此外，ARD喂養(yǎng)增加了α-Sma的蛋白表達(dá)，而ABX或DMB處理會(huì)減弱α-Sma的表達(dá)（圖5e,f）。相比之下，ABX或DMB治療均未顯著逆轉(zhuǎn)ARD誘導(dǎo)的心臟質(zhì)量下降。
圖5. TMAO是減緩小鼠模型腎功能不全的治療靶點(diǎn)
圖6. 用3,3-二甲基1-丁醇（DMB）或抗生素混合物（ABX）治療可減輕富含腺嘌呤的飲食（ARD）誘導(dǎo)的腎纖維化在第一隊(duì)列中發(fā)現(xiàn)的18個(gè)潛在標(biāo)記物中，氧化三甲胺（TMAO）被確定為一個(gè)有希望的標(biāo)記物，并且它與第二隊(duì)列中CKD患者的腎功能最佳相關(guān)。TMAO處理HK-2細(xì)胞后，細(xì)胞活力降低，α-平滑肌肌動(dòng)蛋白表達(dá)上調(diào)。在小鼠中，含有TMAO的飲食減少了腎臟重量，增加了α-平滑肌肌動(dòng)蛋白的蛋白表達(dá)。此外，通過(guò)使用3,3-二甲基-1-丁醇抑制TMAO的生物合成途徑或使用抗生素混合物破壞腸道微生物群功能來(lái)控制TMAO的產(chǎn)生，可以減輕CKD小鼠模型的腎損傷。結(jié)論和意義：本次研究數(shù)據(jù)表明，減少TMAO的產(chǎn)生可能是一種新的策略，可以減輕CKD腎損傷的進(jìn)展。
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