ESC在體外可無限自我更新和分化為機體內任何種類的細胞，在器官再生和細胞替代治療中具有廣闊的應用前景。然而，hESC維持自我更新及發育多能性的分子調控機制還有很多問題尚不清楚，妨礙了將其分化的細胞安全有效地應用于臨床。因此，對人ESC如何維持其自身特性的機制進行深入的研究尤為重要。

研究思路
 

研究結果

1. 全基因組范圍轉錄因子siRNA文庫篩選

研究者首先獲得了一種hESC細胞株SHhES8，然后對此進行了改造，最終得到了一種hESC報告細胞系。這種細胞系含有OCT4調控轉錄的GFP模塊。研究者根據已經公開報道的數據庫中轉錄因子信息，進行全基因組范圍轉錄因子siRNA篩選。通過篩選得到了25種候選對于hESC自我更新重要的轉錄因子，其中OCT4，RUCBL2和SFRS2已經被報道。本研究揭示了很多新的對于hESC維持自我更新重要的轉錄因子。

2. PHB對于hESC的自我更新維持以及人體細胞的重編程是必須的

研究者選擇了高Z score，敲低后引起嚴重分化的PHB作為重點研究對象。PHB在未分化的hESC中高表達，并隨著hESC的分化表達降低。為了研究PHB在全局范圍的影響，研究者分析了PHB基因敲低后轉錄組的變化，發現有3009個基因差異表達顯著（fold change > 2, p <0.05）。通過差異基因的GO分析發現功能富集在了染色質修飾功能上，因此研究者探索了PHB缺失是否能夠改變組蛋白的修飾。研究發現，PHB缺失導致了組蛋白的高甲基化。隨后還發現，在利用干細胞四因子誘導人成纖維細胞回復多能性時，PHB能夠顯著加速這一過程。

3. PHB與HIRA復合體相互作用

為了研究清楚PHB在hESC中如何發揮作用，研究者采用IP和MS的技術發現除了線粒體的一些相關蛋白外，HIRA也與PHB相互作用。進一步研究發現，PHB結構域介導了PHB與HIRA的結合。由于HIRA復合體的成員還有UBN1和CABIN1，研究者繼續研究了PHB與它們的作用。研究發現PHB和HIRA共同調控H3.3在染色質上的富集。PHB敲低后同時影響了HIRA的三種組分的蛋白水平，對mRNA水平無影響。

4. HIRA復合體在hESC中的作用與PHB相似

由于HIRA在hESC中的作用尚不清楚，研究者采用了siRNAs敲低HIRA的表達。研究結果發現，HIRA缺失的hESC出現了嚴重的分化并伴隨著多能性維持核心因子的降低以及細胞系基因標記基因的表達上升。而且，HIRA缺失導致了組蛋白正常修飾的紊亂。

5. PHB與HIRA復合體共同作用控制著IDH的表達

研究者隨后探究了PHB，HIRA對IDH-a-KG代謝通路的影響。研究發現，PHB，HIRA缺失導致了IDH表達顯著減低，并伴隨著細胞內α酮戊二酸的顯著降低。而α酮戊二酸對于hESC干性的自我維持具有重要的作用。

6. PHB和HIRA共同調控H3.3在染色質上的富集，特別是IDHs基因啟動子區域的富集及IDH基因的表達

為了研究清楚PHB怎樣在功能上與HIRA相關以及PHB與HIRA復合體如何調控α酮戊二酸的產量，研究者在上海伯豪生物技術有限公司做了H3.3的ChIP-seq研究。與input相比，H3.3主要富集在轉錄激活基因的TSS區和TES區。PHB和HIRA缺失均能導致H3.3全局性的沉積減少，進而導致了在IDH以及多能性維持基因啟子區H3K4me3， RNAPIIS5P和RNAPII S2p富集的減少。PHB和HIRA缺失，導致在發育相關基因啟動子區EZH2和H3K27me3富集減少，多能性維持基因啟動子區增加。但對于IDH2基因，只有EZH2的富集增加。

7. PHB缺失導致表觀-代謝環路動態變化并改變hESC特性

本研究之前的所有關于PHB缺失后hESC形態的描述，都是發生在siRNA轉染后第四天。為了確定這四天內的動態變化，研究者把這四天分成了四個階段。第一天，細胞形態上并沒有明顯的變化，或只有輕微的變化，細胞系的標記基因也并沒有檢測到。但，組蛋白3各賴氨酸殘基的甲基化水平已經發生顯著增加，同時IDHs和OCT4的水平大幅減少。第二天，細胞形態學和細胞系標記基因的變化開始明顯，并在第三天達到峰值，一直持續到第四天。研究者為了進一步弄清楚這一系列事件發生的順序，評估了6h 和12h時的變化。PHB沉默6h后，只有HIRA復合體元件的表達量顯著降低，其它均沒有變化。在12 h, IDH1和IDH2以及α酮戊二酸顯著降低，這一過程伴隨著組蛋白賴氨酸甲基化修飾的增加。但在這一過程中，并沒有細胞形態學以及細胞系標記基因的明顯改變。
 

研究結論

研究者通過轉錄因子siRNA文庫篩選，得到了25種對于維持hESC干性重要的轉錄因子，并選擇PHB進一步研究。研究發現，PHB缺失后HIRA復合體成員表達降低，組蛋白賴氨酸殘基甲基化修飾增加，隨后IDH1和IDH2以及α酮戊二酸顯著降低。這一表觀-代謝通路的動態變化最終導致了hESC干性的喪失。

原文出處 Zhu Z, Li C, Zeng Y, Ding J, Qu Z, Gu J, Ge L, Tang F, Huang X, Zhou C, Wang P, Zheng D, Jin Y. PHB Associates with the HIRA Complex to Control an Epigenetic-Metabolic Circuit in Human ESCs. Cell Stem Cell.2016(IF:22.387)