抗經(jīng)典豬瘟單克隆抗體抗體結(jié)構(gòu)、靶向抗原、制備流程及應(yīng)用參數(shù)
一、抗體結(jié)構(gòu)特征
- 整體結(jié)構(gòu)：由 2 條重鏈（H 鏈，約 50 kDa）和 2 條輕鏈（L 鏈，約 25 kDa）通過(guò)二硫鍵連接形成 “Y” 型結(jié)構(gòu)，分子量約 150 kDa（IgG）。
- 功能區(qū)域：
- 可變區(qū)（V 區(qū)）：重鏈可變區(qū)（VH）和輕鏈可變區(qū)（VL）組成抗原結(jié)合位點(diǎn)（CDR1-CDR3），負(fù)責(zé)特異性識(shí)別 CSFV 抗原的線(xiàn)性或構(gòu)象表位（E2 蛋白的中和表位多為構(gòu)象表位，依賴(lài)蛋白空間結(jié)構(gòu)）。
- 恒定區(qū)（C 區(qū)）：重鏈恒定區(qū)（CH1-CH3）決定抗體效應(yīng)功能（如 IgG2a 的 Fc 段可介導(dǎo)補(bǔ)體依賴(lài)的細(xì)胞毒性（CDC）或調(diào)理作用），輕鏈恒定區(qū)（CL）輔助維持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。
- 修飾特征：部分單抗的 Fc 段存在 N - 糖基化修飾，影響抗體在體內(nèi)的半衰期（若用于被動(dòng)免疫）和與 Fc 受體的結(jié)合能力。
- E2 蛋白：全長(zhǎng)約 370 個(gè)氨基酸，含多個(gè)中和表位（如 A、B、C、D 表位），其中 A 表位（位于 N 端）是中和活性的核心區(qū)域，多數(shù)具有中和功能的單抗靶向此表位。E2 蛋白高度保守（不同毒株間同源性約 80%-95%），但疫苗株與野毒株的表位可能存在細(xì)微差異（可用于區(qū)分免疫與感染）。
- 其他抗原：少數(shù)單抗靶向 E0 蛋白（參與病毒釋放）或 Core 蛋白（用于病毒核酸檢測(cè)的輔助驗(yàn)證），但因 E0 和 Core 的免疫原性較弱，應(yīng)用范圍較窄。
- 疫苗株：C 株（兔化弱毒疫苗，2.1 亞型，E2 蛋白序列穩(wěn)定，是單抗制備的常用免疫原）、HCLV 株（豬瘟兔化弱毒疫苗）。
- 野毒株：石門(mén)株（強(qiáng)毒，1.1 亞型）、Alfort 株（1 型）、Brescia 株（1 型）、GLV 株（2 型）等。
- 重組抗原：通過(guò)桿狀病毒 - 昆蟲(chóng)細(xì)胞、CHO 細(xì)胞表達(dá)的重組 E2 蛋白（保留天然構(gòu)象，含完整中和表位），是單抗制備的首選免疫原（純度高、安全性好）。
1. 制備步驟
- 免疫原制備：優(yōu)先選擇重組 E2 蛋白（純度≥95%，濃度 50-100μg / 劑，需驗(yàn)證構(gòu)象表位完整性），或滅活 CSFV 病毒（滴度≥10⁶ TCID₅₀/mL，需無(wú)殘留毒力）。
- 動(dòng)物免疫：BALB/c 小鼠腹腔免疫，基礎(chǔ)免疫 3 次（間隔 2 周），加強(qiáng)免疫 1 次（融合前 3 天），血清效價(jià)需≥1:10⁴（間接 ELISA 檢測(cè)，以重組 E2 蛋白為包被抗原）。
- 細(xì)胞融合：取免疫小鼠脾臟 B 淋巴細(xì)胞與 SP2/0 骨髓瘤細(xì)胞融合，融合率≥30%，雜交瘤克隆形成率≥50%。
- 篩選與克隆：
- 初篩：間接 ELISA（檢測(cè)針對(duì)重組 E2 蛋白的抗體）。
- 復(fù)篩：免疫熒光（IFA，檢測(cè)感染 CSFV 的 PK-15 細(xì)胞中的特異性熒光）、中和試驗(yàn)（檢測(cè)對(duì)活病毒的中和活性，中和效價(jià)≥1:16 為陽(yáng)性）。
- 克隆純化：有限稀釋法克隆 3 次以上，確保單克隆性（染色體數(shù)目穩(wěn)定，約 90-110 條）。
- 抗體生產(chǎn)：腹水誘生（效價(jià) 1:10⁶-10⁸）或無(wú)血清懸浮培養(yǎng)（濃度 20-100μg/mL），經(jīng) Protein A/G 親和純化后純度≥95%。
- 雜交瘤穩(wěn)定性：連續(xù)傳代 60 次后，抗體分泌能力無(wú)顯著下降（效價(jià)波動(dòng)≤20%）。
- 抗體效價(jià)：ELISA 效價(jià)（腹水）≥1:10⁶，中和效價(jià)（針對(duì)強(qiáng)毒株）≥1:32。
1. 特異性
- 抗原特異性：僅與 CSFV 的靶抗原（如 E2）結(jié)合，不識(shí)別 CSFV 的非結(jié)構(gòu)蛋白（如 NS3、NS5）或其他病毒（如豬繁殖與呼吸綜合征病毒 PRRSV、豬偽狂犬病病毒 PRV）的抗原。
- 病毒特異性：通過(guò) IFA 和中和試驗(yàn)驗(yàn)證，僅與 CSFV 反應(yīng)，不與同屬的牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）、邊界病病毒（BDV）交叉反應(yīng)（因三者 E2 蛋白存在部分同源序列，需嚴(yán)格排除交叉）。
- 與同屬病毒：優(yōu)質(zhì)單抗對(duì) BVDV、BDV 的交叉反應(yīng)率≤5%（ELISA 檢測(cè) OD 值比值 < 0.05）。
- 與不同基因型 CSFV：因 E2 蛋白保守性高，單抗通常可交叉識(shí)別 1-3 型毒株，對(duì) 1 型和 2 型毒株的識(shí)別率≥90%，對(duì) 3 型的交叉率≥85%。
- 區(qū)分疫苗株與野毒株：部分單抗可識(shí)別野毒株特有的表位（如石門(mén)株的 D 表位），對(duì)疫苗株（C 株）無(wú)反應(yīng)，交叉率≤1%，可用于 “鑒別診斷（DIVA）” 試劑。
- 親和力：通過(guò) SPR（表面等離子體共振）或 ELISA 競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)定，解離常數(shù)（KD）通常為 10⁻⁸-10⁻¹⁰ M（KD 值越小，親和力越高，中和活性越強(qiáng)）。
- 中和活性：在細(xì)胞水平可有效抑制 CSFV 感染，50% 抑制濃度（IC₅₀）≤1μg/mL（針對(duì) 100 TCID₅₀的病毒）。
- 熱穩(wěn)定性：37℃放置 7 天，效價(jià)保留率≥80%；-20℃凍存 3 年，活性無(wú)顯著下降。
- 應(yīng)用適應(yīng)性：適用于 ELISA（檢測(cè)抗原或抗體）、IFA（病毒定位）、Western blot（僅識(shí)別變性抗原的單抗）、病毒中和試驗(yàn)等，工作濃度范圍：ELISA 1:2000-1:10000，IFA 1:500-1:2000。
- 診斷試劑：作為核心試劑用于 CSFV 抗原檢測(cè)（如雙抗體夾心 ELISA）、病毒分型及 “免疫 - 感染” 鑒別診斷。
- 基礎(chǔ)研究：解析 E2 蛋白的功能（如與宿主細(xì)胞受體結(jié)合機(jī)制）、病毒入侵途徑。
- 被動(dòng)免疫：高中和活性的單抗可用于仔豬緊急預(yù)防或發(fā)病豬的早期治療（需驗(yàn)證安全性和半衰期）。
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