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抗犬腺病毒 1/2 型單克隆抗體的研究背景與制備流程

瀏覽次數(shù):158 發(fā)布日期:2025-6-30  來源:本站 僅供參考,謝絕轉(zhuǎn)載,否則責(zé)任自負(fù)
一、犬腺病毒與單克隆抗體的研究背景

犬腺病毒(Canine Adenovirus, CAV)分為 CAV-1 和 CAV-2 兩種血清型:

  • CAV-1:可引起犬傳染性肝炎(ICH),導(dǎo)致肝臟、腎臟等器官損傷;
  • CAV-2:主要引起犬傳染性喉氣管炎(犬窩咳),常與其他呼吸道病毒(如犬副流感病毒、犬瘟熱病毒)協(xié)同感染。
    單克隆抗體(mAb)因其高特異性和均一性,在 CAV-1/2 的檢測、分型及致病機制研究中具有重要價值。

二、抗 CAV-1/2 單克隆抗體的制備流程
1. 抗原制備
  • CAV-1/2 抗原選擇: 
    • 病毒顆粒抗原:通過細(xì)胞培養(yǎng)(如犬腎細(xì)胞系 MDCK、A72 細(xì)胞)增殖病毒,經(jīng)滅活、純化后獲得全病毒抗原。
    • 特異性蛋白抗原:選擇 CAV-1/2 的結(jié)構(gòu)蛋白(如六鄰體蛋白 Hexon、纖維蛋白 Fiber)或非結(jié)構(gòu)蛋白,通過基因工程技術(shù)(如大腸桿菌 / 桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng))制備重組抗原。
  • 抗原純化:采用密度梯度離心(如 CsCl 離心)或?qū)游龇ㄈコ拗骷?xì)胞蛋白,確保抗原純度。
2. 免疫動物與脾細(xì)胞獲取
  • 實驗動物:常用 Balb/c 小鼠或大鼠,通過腹腔注射抗原(輔以弗氏佐劑),免疫 3-4 次(間隔 2-3 周),末次免疫后 3-5 天取脾臟分離脾細(xì)胞。
  • 免疫策略:若需制備同時識別 CAV-1/2 的交叉反應(yīng)抗體,可使用混合抗原免疫;若需分型特異性抗體,需分別使用 CAV-1 和 CAV-2 抗原免疫。
3. 細(xì)胞融合與雜交瘤篩選
  • 細(xì)胞融合:脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞(如 SP2/0、NS0)在 PEG 或電融合條件下融合,通過 HAT 培養(yǎng)基篩選雜交瘤細(xì)胞。
  • 篩選方法: 
    • 間接 ELISA:以 CAV-1/2 抗原包被板,篩選能分泌特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞株。
    • 中和試驗(NT):檢測抗體對病毒感染細(xì)胞的中和能力,篩選具有中和活性的單克隆抗體。
    • 免疫熒光(IFA):驗證抗體與病毒感染細(xì)胞的結(jié)合特異性,排除非特異性反應(yīng)。
4. 單克隆抗體的擴增與純化
  • 體內(nèi)擴增:雜交瘤細(xì)胞注射至小鼠腹腔,收集腹水,通過 Protein A/G 親和層析或硫酸銨沉淀法純化抗體。
  • 體外擴增:無血清培養(yǎng)基大規(guī)模培養(yǎng),結(jié)合層析技術(shù)純化,適用于工業(yè)化生產(chǎn)。

三、抗 CAV-1/2 單克隆抗體的特異性與應(yīng)用
1. 特異性驗證
  • 型間交叉反應(yīng):通過 ELISA/Western blot 檢測抗體與 CAV-1 和 CAV-2 的結(jié)合活性,區(qū)分: 
    • 型特異性抗體:僅識別 CAV-1 或 CAV-2 單一型別;
    • 交叉反應(yīng)抗體:同時識別 CAV-1 和 CAV-2(如針對保守抗原表位)。
  • 中和活性驗證:通過病毒中和試驗確定抗體是否能阻斷病毒與宿主細(xì)胞受體的結(jié)合,評估其潛在治療價值。
2. 主要應(yīng)用領(lǐng)域
  • 病毒檢測與分型: 
    • ELISA / 膠體金試紙條:作為捕獲抗體或檢測抗體,用于犬血清、分泌物(如呼吸道拭子)中的 CAV-1/2 抗原檢測。例如,CAV-2 檢測試紙條可輔助診斷犬窩咳。
    • 免疫熒光(IFA)/ 免疫組化(IHC):定位病毒在感染組織中的分布(如 CAV-1 感染的肝臟細(xì)胞),輔助病理診斷。
  • 病毒中和機制研究:通過單克隆抗體識別的抗原表位,分析 CAV-1/2 的入侵機制(如纖維蛋白與宿主細(xì)胞受體的結(jié)合位點)。
  • 治療性抗體開發(fā):針對 CAV-1 引起的重癥肝炎,具有中和活性的單克隆抗體可作為被動免疫制劑,與抗病毒藥物聯(lián)用提高療效。
  • 疫苗研發(fā)工具:篩選能識別病毒保護(hù)性抗原表位的單克隆抗體,指導(dǎo)亞單位疫苗或基因工程疫苗的設(shè)計。

四、抗 CAV-1/2 單克隆抗體的應(yīng)用案例
1. CAV-1/2 分型檢測 ELISA
  • 原理: 
    • 包被板分別固定 CAV-1 和 CAV-2 特異性抗原;
    • 待檢樣本中的抗體與抗原結(jié)合后,通過酶標(biāo)二抗顯色,根據(jù) OD 值判斷樣本中 CAV-1 或 CAV-2 抗體的類型及滴度。
  • 優(yōu)勢:相比傳統(tǒng)血清學(xué)方法,單克隆抗體 ELISA 具有更高的特異性和重復(fù)性,可區(qū)分兩種血清型的感染。
2. CAV-2 中和抗體的治療潛力
  • 實驗?zāi)P?/strong>:建立 CAV-2 感染的犬類模型,注射特異性中和單克隆抗體,觀察其對呼吸道癥狀(如咳嗽、流涕)的緩解效果及病毒載量的下降趨勢。
  • 應(yīng)用價值:對于免疫功能低下的幼犬,單克隆抗體可作為緊急干預(yù)手段,降低繼發(fā)細(xì)菌感染的風(fēng)險。

五、局限性與發(fā)展方向
1. 局限性
  • 病毒抗原變異:CAV-1/2 的結(jié)構(gòu)蛋白可能因基因突變導(dǎo)致抗原表位改變,影響單克隆抗體的結(jié)合效率。
  • 生產(chǎn)成本與規(guī)模化:傳統(tǒng)雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體周期長、成本高,需結(jié)合重組抗體技術(shù)(如噬菌體展示、酵母展示)優(yōu)化生產(chǎn)流程。
2. 發(fā)展方向
  • 雙特異性抗體:設(shè)計同時識別 CAV-1 和 CAV-2 保守表位的雙特異性抗體,提高檢測或治療的廣譜性。
  • 納米抗體(VHH)開發(fā):從駱駝科動物中篩選抗 CAV-1/2 的納米抗體,其分子量小、穩(wěn)定性高,更適合作為診斷探針或口服治療劑。
  • 聯(lián)合檢測體系:將抗 CAV-1/2 單克隆抗體與抗犬瘟熱、犬細(xì)小病毒等抗體組合,開發(fā)多聯(lián)檢測試劑盒,滿足臨床快速篩查需求。
發(fā)布者:費雪(杭州)醫(yī)學(xué)研究有限公司
聯(lián)系電話:13818883417
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