Caco-2細(xì)胞（人結(jié)腸腺癌細(xì)胞）培養(yǎng)技術(shù)要點
Caco-2細(xì)胞模型是十幾年來國外廣泛采用的一種研究藥物小腸吸收的體外模型，具有相對簡單、重復(fù)性較好、應(yīng)用范圍較廣的特點。其來源于人的直腸癌，結(jié)構(gòu)和功能類似于人小腸上皮細(xì)胞，并含有與小腸刷狀緣上皮相關(guān)的酶系。這些性質(zhì)可以恒定維持約20天。由于Caco-2細(xì)胞性質(zhì)類似小腸上皮細(xì)胞，因此可以在這段時間進(jìn)行藥物的跨膜轉(zhuǎn)運實驗。Caco-2細(xì)胞也是研究腸道屏障、藥物吸收和轉(zhuǎn)運機制的經(jīng)典模型，但其培養(yǎng)過程對操作細(xì)節(jié)要求極高。一個微小的疏漏可能導(dǎo)致分化失敗、污染或?qū)嶒灲Y(jié)果偏差。本文梳理了Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)的技術(shù)，助您輕松避開“雷區(qū)”。
細(xì)胞來源
Caco-2細(xì)胞是一種人結(jié)腸腺癌細(xì)胞系，最初是從一位72歲男性患者的直腸原位癌組織中分離出來建立的。這些細(xì)胞在體外培養(yǎng)時，能夠分化成類似小腸上皮細(xì)胞的形態(tài)，表現(xiàn)出微絨毛等結(jié)構(gòu)，當(dāng)細(xì)胞長滿時，可表現(xiàn)出具有分化的腸上皮細(xì)胞的特征。Caco-2細(xì)胞因其與小腸上皮細(xì)胞在結(jié)構(gòu)和功能上的相似性，被廣泛用于模擬體內(nèi)腸道吸收和轉(zhuǎn)運的實驗。因其在模擬人類腸道吸收和轉(zhuǎn)運方面的能力，已成為研究藥物代謝和口服生物利用度的重要工具。細(xì)胞表達(dá)維甲酸結(jié)合蛋白I和維甲酸結(jié)合蛋白II。
中喬新舟出庫圖 4X
中喬新舟出庫圖10X
Caco-2細(xì)胞特性：
培養(yǎng)條件：RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基（中喬新舟 貨號：ZQ-200）+10%胎牛血清 (中喬新舟 貨號：ZQ0500）+1%P/S（貨號：CSP006）或者完全培養(yǎng)基（ZM0056）
Caco-2細(xì)胞專用培養(yǎng)基已包含成分包含基礎(chǔ)培養(yǎng)基、血清、雙抗等細(xì)胞生長需要的其他添加物。由中喬新舟技術(shù)團(tuán)隊精心優(yōu)化，經(jīng)過長期測試，可保持細(xì)胞良好的生長狀態(tài)。
倍增時間：大約32~80小時
消化時間： 5-15 min
傳代頻率：1：2傳代3天可再次傳代
l 復(fù)蘇或傳代后細(xì)胞貼壁較慢，大量細(xì)胞會漂浮并存在一些碎片，最終會以島狀形態(tài)貼壁并擴(kuò)散生長。為了避免干擾細(xì)胞貼壁，48小時內(nèi)不要換液。
l 細(xì)胞形態(tài)不均一，有一些含有液泡的巨大細(xì)胞，該細(xì)胞培養(yǎng)過程中會有黑色顆粒物，屬正常現(xiàn)象。
l 該細(xì)胞對血清質(zhì)量較為敏感，我司建議您使用品牌優(yōu)質(zhì)胎牛血清進(jìn)行培養(yǎng)或選擇訂購我司配套Caco-2完全培養(yǎng)液。
一、 細(xì)胞復(fù)蘇與傳代
1、快速解凍，減少應(yīng)激
Caco-2細(xì)胞對溫度敏感，需嚴(yán)格遵循“37℃水浴快速解凍→逐滴添加預(yù)溫培養(yǎng)基→低速離心去DMSO”的步驟，避免細(xì)胞膜損傷。復(fù)蘇后48小時不用去動細(xì)胞。細(xì)胞會緩慢貼壁后成塊狀增殖生長起來。
2、傳代密度與時間控制
1）傳代密度：建議接種密度為2-4×10⁴ cells/cm²，密度過低會延長增殖期，密度過高易導(dǎo)致堆積分化異常。
2）傳代間隔：通常每3-5天傳代一次（80-90%融合時），因其增殖速度較慢，切勿頻繁操作。
3、消化技巧
由于消化時間比較長，盡量在胰酶的作用下充分消化脫落，減少吹打?qū)?xì)胞帶來的機械損傷。以下是我司的消化技巧：建議消化前用pbs多洗幾次，約2-4次，每次3-5ml,盡量去除干凈pbs后，加入2ml的0.25%胰酶（+0.02% EDTA），放入培養(yǎng)箱5-8min左右，從培養(yǎng)箱拿出，用手掌心拍打瓶尾部，觀察細(xì)胞脫落情況，(沒有脫落繼續(xù)放入培養(yǎng)箱)直到顯微鏡下觀察細(xì)胞成流沙狀態(tài)脫落約80%左右，加入3-5ml完全培養(yǎng)基終止消化。使用巴氏吸管輕柔吹打瓶內(nèi)各部位約4-6下，收集細(xì)胞懸液離心，1000轉(zhuǎn)5分鐘.去除上清液，細(xì)胞沉淀用手指波動彈松后加入完全培養(yǎng)基進(jìn)行分瓶。（以上體積是T25瓶的添加量）。
二、 分化培養(yǎng)：
Caco-2細(xì)胞的分化培養(yǎng)主要包括將細(xì)胞培養(yǎng)在多孔的可滲透聚碳酸酯膜上，形成連續(xù)的單層，從而模擬腸上皮屏障的功能。Caco-2細(xì)胞在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下匯合后，會自發(fā)分化為腸上皮樣細(xì)胞，具有與小腸上皮細(xì)胞相似的形態(tài)和功能。
分化培養(yǎng)的具體步驟和條件1：
1、培養(yǎng)基選擇：Caco-2細(xì)胞的分化培養(yǎng)通常采用5.55 mM D-葡萄糖 EMEM 作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并補充10%的胎牛血清（FBS）和雙抗（青霉素/鏈霉素，P/S）以支持細(xì)胞的生長和防止污染。具體而言，5.55 mM D-葡萄糖 EMEM培養(yǎng)基中需加入10%的FBS和1%的P/S，以確保細(xì)胞獲得足夠的營養(yǎng)物質(zhì)和生長因子，同時維持無菌的生長環(huán)境，在37℃、5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
2、 細(xì)胞接種：將Caco-2細(xì)胞接種在多孔的可滲透聚碳酸酯膜上，形成單層細(xì)胞。
3、分化條件：細(xì)胞在特定條件下培養(yǎng)時，會發(fā)生分化和極化，轉(zhuǎn)變?yōu)轭愃朴谂帕性谛∧c中的腸細(xì)胞，具有腸上皮細(xì)胞樣緊密連接、微絨毛、酶和轉(zhuǎn)運蛋白等特性。
三、常見問題與解決方案
1、細(xì)胞不貼壁
當(dāng)Caco-2細(xì)胞在培養(yǎng)基中的胎牛血清比例降至10%時，細(xì)胞的貼壁性會明顯下降。為了解決這個問題，建議使用高質(zhì)量的胎牛血清，并確保血清比例不低于20%。
2、細(xì)胞難以消化
Caco-2細(xì)胞的連接非常緊密，消化時間通常需要5-10分鐘。在消化過程中，細(xì)胞往往難以被吹散為單個細(xì)胞，通常形成小的細(xì)胞團(tuán)塊即可終止消化。
3、細(xì)胞生長緩慢
Caco-2細(xì)胞的倍增時間約為72小時，傳代周期較長，通常約一周傳代一次。細(xì)胞貼壁和生長都較為緩慢，建議接種后等待48小時以上完成貼壁。
4、細(xì)胞老化
Caco-2細(xì)胞容易老化，表現(xiàn)為細(xì)胞中出現(xiàn)許多空泡和黑點。這可能是由于細(xì)胞裂解或污染所致。建議定期檢查培養(yǎng)環(huán)境和條件，必要時進(jìn)行傳代或更換培養(yǎng)基。
5、支原體污染
Caco-2細(xì)胞容易受到支原體污染，表現(xiàn)為細(xì)胞中出現(xiàn)黑點或黑膠蟲。這通常需要重新培養(yǎng)或更換培養(yǎng)環(huán)境。
解決方法：1）調(diào)整培養(yǎng)條件：確保使用高質(zhì)量的胎牛血清，并調(diào)整血清比例至20%以上，以改善細(xì)胞的貼壁性。2）優(yōu)化消化過程：在消化過程中分次進(jìn)行，確保細(xì)胞能夠被吹散為小的細(xì)胞團(tuán)塊即可終止消化。3）控制細(xì)胞密度和傳代頻率：避免頻繁傳代，確保細(xì)胞在80%密度時進(jìn)行傳代，以維持細(xì)胞的健康狀態(tài)。4）定期檢查培養(yǎng)環(huán)境和條件：定期檢查培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)環(huán)境是否出現(xiàn)異常，及時處理污染問題。
參考文獻(xiàn)：
1. Harleen Kaur , Régis Moreau .mTORC1 silencing during intestinal epithelial Caco-2 cell differentiation is mediated by the activation of the AMPK/TSC2 pathway.
細(xì)胞來源
Caco-2細(xì)胞是一種人結(jié)腸腺癌細(xì)胞系，最初是從一位72歲男性患者的直腸原位癌組織中分離出來建立的。這些細(xì)胞在體外培養(yǎng)時，能夠分化成類似小腸上皮細(xì)胞的形態(tài)，表現(xiàn)出微絨毛等結(jié)構(gòu)，當(dāng)細(xì)胞長滿時，可表現(xiàn)出具有分化的腸上皮細(xì)胞的特征。Caco-2細(xì)胞因其與小腸上皮細(xì)胞在結(jié)構(gòu)和功能上的相似性，被廣泛用于模擬體內(nèi)腸道吸收和轉(zhuǎn)運的實驗。因其在模擬人類腸道吸收和轉(zhuǎn)運方面的能力，已成為研究藥物代謝和口服生物利用度的重要工具。細(xì)胞表達(dá)維甲酸結(jié)合蛋白I和維甲酸結(jié)合蛋白II。
中喬新舟出庫圖 4X
中喬新舟出庫圖10X
Caco-2細(xì)胞特性：
培養(yǎng)條件：RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基（中喬新舟 貨號：ZQ-200）+10%胎牛血清 (中喬新舟 貨號：ZQ0500）+1%P/S（貨號：CSP006）或者完全培養(yǎng)基（ZM0056）
Caco-2細(xì)胞專用培養(yǎng)基已包含成分包含基礎(chǔ)培養(yǎng)基、血清、雙抗等細(xì)胞生長需要的其他添加物。由中喬新舟技術(shù)團(tuán)隊精心優(yōu)化，經(jīng)過長期測試，可保持細(xì)胞良好的生長狀態(tài)。
倍增時間：大約32~80小時
消化時間： 5-15 min
傳代頻率：1：2傳代3天可再次傳代
l 復(fù)蘇或傳代后細(xì)胞貼壁較慢，大量細(xì)胞會漂浮并存在一些碎片，最終會以島狀形態(tài)貼壁并擴(kuò)散生長。為了避免干擾細(xì)胞貼壁，48小時內(nèi)不要換液。
l 細(xì)胞形態(tài)不均一，有一些含有液泡的巨大細(xì)胞，該細(xì)胞培養(yǎng)過程中會有黑色顆粒物，屬正常現(xiàn)象。
l 該細(xì)胞對血清質(zhì)量較為敏感，我司建議您使用品牌優(yōu)質(zhì)胎牛血清進(jìn)行培養(yǎng)或選擇訂購我司配套Caco-2完全培養(yǎng)液。
一、 細(xì)胞復(fù)蘇與傳代
1、快速解凍，減少應(yīng)激
Caco-2細(xì)胞對溫度敏感，需嚴(yán)格遵循“37℃水浴快速解凍→逐滴添加預(yù)溫培養(yǎng)基→低速離心去DMSO”的步驟，避免細(xì)胞膜損傷。復(fù)蘇后48小時不用去動細(xì)胞。細(xì)胞會緩慢貼壁后成塊狀增殖生長起來。
2、傳代密度與時間控制
1）傳代密度：建議接種密度為2-4×10⁴ cells/cm²，密度過低會延長增殖期，密度過高易導(dǎo)致堆積分化異常。
2）傳代間隔：通常每3-5天傳代一次（80-90%融合時），因其增殖速度較慢，切勿頻繁操作。
3、消化技巧
由于消化時間比較長，盡量在胰酶的作用下充分消化脫落，減少吹打?qū)?xì)胞帶來的機械損傷。以下是我司的消化技巧：建議消化前用pbs多洗幾次，約2-4次，每次3-5ml,盡量去除干凈pbs后，加入2ml的0.25%胰酶（+0.02% EDTA），放入培養(yǎng)箱5-8min左右，從培養(yǎng)箱拿出，用手掌心拍打瓶尾部，觀察細(xì)胞脫落情況，(沒有脫落繼續(xù)放入培養(yǎng)箱)直到顯微鏡下觀察細(xì)胞成流沙狀態(tài)脫落約80%左右，加入3-5ml完全培養(yǎng)基終止消化。使用巴氏吸管輕柔吹打瓶內(nèi)各部位約4-6下，收集細(xì)胞懸液離心，1000轉(zhuǎn)5分鐘.去除上清液，細(xì)胞沉淀用手指波動彈松后加入完全培養(yǎng)基進(jìn)行分瓶。（以上體積是T25瓶的添加量）。
二、 分化培養(yǎng)：
Caco-2細(xì)胞的分化培養(yǎng)主要包括將細(xì)胞培養(yǎng)在多孔的可滲透聚碳酸酯膜上，形成連續(xù)的單層，從而模擬腸上皮屏障的功能。Caco-2細(xì)胞在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下匯合后，會自發(fā)分化為腸上皮樣細(xì)胞，具有與小腸上皮細(xì)胞相似的形態(tài)和功能。
分化培養(yǎng)的具體步驟和條件1：
1、培養(yǎng)基選擇：Caco-2細(xì)胞的分化培養(yǎng)通常采用5.55 mM D-葡萄糖 EMEM 作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并補充10%的胎牛血清（FBS）和雙抗（青霉素/鏈霉素，P/S）以支持細(xì)胞的生長和防止污染。具體而言，5.55 mM D-葡萄糖 EMEM培養(yǎng)基中需加入10%的FBS和1%的P/S，以確保細(xì)胞獲得足夠的營養(yǎng)物質(zhì)和生長因子，同時維持無菌的生長環(huán)境，在37℃、5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
2、 細(xì)胞接種：將Caco-2細(xì)胞接種在多孔的可滲透聚碳酸酯膜上，形成單層細(xì)胞。
3、分化條件：細(xì)胞在特定條件下培養(yǎng)時，會發(fā)生分化和極化，轉(zhuǎn)變?yōu)轭愃朴谂帕性谛∧c中的腸細(xì)胞，具有腸上皮細(xì)胞樣緊密連接、微絨毛、酶和轉(zhuǎn)運蛋白等特性。
三、常見問題與解決方案
1、細(xì)胞不貼壁
當(dāng)Caco-2細(xì)胞在培養(yǎng)基中的胎牛血清比例降至10%時，細(xì)胞的貼壁性會明顯下降。為了解決這個問題，建議使用高質(zhì)量的胎牛血清，并確保血清比例不低于20%。
2、細(xì)胞難以消化
Caco-2細(xì)胞的連接非常緊密，消化時間通常需要5-10分鐘。在消化過程中，細(xì)胞往往難以被吹散為單個細(xì)胞，通常形成小的細(xì)胞團(tuán)塊即可終止消化。
3、細(xì)胞生長緩慢
Caco-2細(xì)胞的倍增時間約為72小時，傳代周期較長，通常約一周傳代一次。細(xì)胞貼壁和生長都較為緩慢，建議接種后等待48小時以上完成貼壁。
4、細(xì)胞老化
Caco-2細(xì)胞容易老化，表現(xiàn)為細(xì)胞中出現(xiàn)許多空泡和黑點。這可能是由于細(xì)胞裂解或污染所致。建議定期檢查培養(yǎng)環(huán)境和條件，必要時進(jìn)行傳代或更換培養(yǎng)基。
5、支原體污染
Caco-2細(xì)胞容易受到支原體污染，表現(xiàn)為細(xì)胞中出現(xiàn)黑點或黑膠蟲。這通常需要重新培養(yǎng)或更換培養(yǎng)環(huán)境。
解決方法：1）調(diào)整培養(yǎng)條件：確保使用高質(zhì)量的胎牛血清，并調(diào)整血清比例至20%以上，以改善細(xì)胞的貼壁性。2）優(yōu)化消化過程：在消化過程中分次進(jìn)行，確保細(xì)胞能夠被吹散為小的細(xì)胞團(tuán)塊即可終止消化。3）控制細(xì)胞密度和傳代頻率：避免頻繁傳代，確保細(xì)胞在80%密度時進(jìn)行傳代，以維持細(xì)胞的健康狀態(tài)。4）定期檢查培養(yǎng)環(huán)境和條件：定期檢查培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)環(huán)境是否出現(xiàn)異常，及時處理污染問題。
參考文獻(xiàn)：
1. Harleen Kaur , Régis Moreau .mTORC1 silencing during intestinal epithelial Caco-2 cell differentiation is mediated by the activation of the AMPK/TSC2 pathway.
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