免疫熒光(IF)實(shí)驗(yàn)樣本要求與實(shí)驗(yàn)操作步驟介紹
免疫熒光(immunofluorescence，IF)，通常是指用熒光標(biāo)記的抗體示蹤或檢查樣品中相應(yīng)抗原的方法。根據(jù)抗原抗體反應(yīng)，將不影響抗原抗體相互作用的熒光分子標(biāo)記在抗體上，與其相應(yīng)的抗原反應(yīng)后，在熒光顯微鏡下針對(duì)熒光標(biāo)記分子的激發(fā)光發(fā)射光進(jìn)行觀察，從而檢測(cè)目的指標(biāo)的相對(duì)含量、在組織細(xì)胞中的定位。
樣本準(zhǔn)備要求：
1、取材手法：要求取材器械鋒利，盡可能選擇薄的手術(shù)刀片，減少剪刀的使用，避免擠壓挫傷標(biāo)本。較準(zhǔn)確地取到目的部位組織，夾取標(biāo)本的時(shí)候盡量遠(yuǎn)離目的區(qū)域組織。
2、取材速度：盡量保證樣本離體后5min內(nèi)放入到合適的固定液內(nèi)。如果一只動(dòng)物同時(shí)取多種器官，優(yōu)先取消化器官，其次取中樞神經(jīng)系統(tǒng)器官(腦，脊髓等)，皮膚、肌肉等可放到最后取。
3、組織塊大小：未經(jīng)灌注的標(biāo)本組織厚度不要超過1cm。
4、固定液：針對(duì)不同的標(biāo)本特點(diǎn)及實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊欢ㄒx用正確的固定液。
5、固定液量：固定液體積為組織的10倍，且組織能在容器內(nèi)自由移動(dòng)，不貼壁不沉底，并做好清晰標(biāo)記。
6、固定溫度：常溫即可，無需冷藏，切勿冷凍結(jié)冰，否則固定液結(jié)冰形成冰晶嚴(yán)重破壞組織形態(tài)結(jié)構(gòu)。
樣本準(zhǔn)備要求：
1、取材手法：要求取材器械鋒利，盡可能選擇薄的手術(shù)刀片，減少剪刀的使用，避免擠壓挫傷標(biāo)本。較準(zhǔn)確地取到目的部位組織，夾取標(biāo)本的時(shí)候盡量遠(yuǎn)離目的區(qū)域組織。
2、取材速度：盡量保證樣本離體后5min內(nèi)放入到合適的固定液內(nèi)。如果一只動(dòng)物同時(shí)取多種器官，優(yōu)先取消化器官，其次取中樞神經(jīng)系統(tǒng)器官(腦，脊髓等)，皮膚、肌肉等可放到最后取。
3、組織塊大小：未經(jīng)灌注的標(biāo)本組織厚度不要超過1cm。
4、固定液：針對(duì)不同的標(biāo)本特點(diǎn)及實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊欢ㄒx用正確的固定液。
5、固定液量：固定液體積為組織的10倍，且組織能在容器內(nèi)自由移動(dòng)，不貼壁不沉底，并做好清晰標(biāo)記。
6、固定溫度：常溫即可，無需冷藏，切勿冷凍結(jié)冰，否則固定液結(jié)冰形成冰晶嚴(yán)重破壞組織形態(tài)結(jié)構(gòu)。
實(shí)驗(yàn)流程圖
操作步驟：
1、細(xì)胞準(zhǔn)備：對(duì)單層生長(zhǎng)細(xì)胞，在傳代培養(yǎng)時(shí)，將細(xì)胞接種到預(yù)先放置有處理過的蓋玻片的培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞接近長(zhǎng)成單層后取出蓋玻片，PBS洗兩次；對(duì)懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)細(xì)胞，用PBS離心洗滌（1000rpm,5min）2次，用細(xì)胞離心甩片機(jī)制備細(xì)胞片或直接制備細(xì)胞涂片。
2、固定：根據(jù)需要選擇適當(dāng)?shù)墓潭▌┕潭?xì)胞。固定完畢后的細(xì)胞可置于含疊氮納的PBS中4℃保存3個(gè)月。PBS洗滌3×5 min.
3、通透：使用交聯(lián)劑（如多聚甲醛）固定后的細(xì)胞，一般需要在加入抗體孵育前，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行通透處理，以保證抗體能夠到達(dá)抗原部位。選擇通透劑應(yīng)充分考慮抗原蛋白的性質(zhì)。通透的時(shí)間一般在5-15min.通透后用PBS洗滌3×5 min.
4、封閉：使用封閉液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行封閉，時(shí)間一般為30min.
5、一抗結(jié)合：室溫孵育1h或者4℃過夜。PBST漂洗3次，每次沖洗5min.
6、二抗結(jié)合：間接免疫熒光需要使用二抗。室溫避光孵育1h.PBST漂洗3次，每次沖洗5min后，再用蒸餾水漂洗一次。
7、封片及檢測(cè)：滴加封片劑一滴，封片，熒光顯微鏡檢查。
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