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原代培養

一、準備工作
 

1、儀器設備

CO2 培養箱、雙人單面超凈臺、倒置顯微鏡、臺式冷凍離心機、水浴鍋或水浴搖床，醫用冰箱、-80℃冰箱、移液器（一套）、眼科剪、眼科鑷。
 

2、試劑耗材

小鼠正常肝類器官培養基、基質膠（低因子，無酚紅）、60mm細胞培養皿、100μm濾篩、15ml離心管、1.5ml EP管若干、24孔細胞培養板、金屬冰盒、眼科剪刀、眼科鑷。

 

二、操作流程

1、類器官操作流程——樣本準備
 

1）將組織放入含有預冷的（2-8°C）組織保存液 E 的取樣瓶中（浸沒整個組織），4℃從醫院/實驗室取回。

2）將取樣瓶消毒，組織取出放入培養皿樣本拍照，并登記，大小，顏色，軟硬程度，組織類型等信息。

2、類器官操作流程——清洗、剪碎
 

在60mm細胞培養皿里用2-3ml原代培養緩沖液 B浸泡。用原代培養緩沖液 B清洗三次（每次更換培養皿）后剪碎，剪成大約1-3mm3的組織塊，靜置2次。

3、類器官操作流程——消化、過濾
 

1）向EP管中加入適量小鼠正常肝原代組織消化液 C（消化液是組織體積的3-5倍）在37℃進行消化10-15min（消化過程中隨時觀察消化情況）。

2）取少量液體在顯微鏡下觀察，鏡下觀察到較多的單個細胞或 70um 以下的細胞簇后， 加入3倍體積原代培養緩沖液 B 終止消化，用槍頭輕柔吹打可以看到液體變渾濁。
 
3）使用100μm濾篩進行過濾，取少量濾液在鏡下進行觀察。將濾液收集到15ml離心管，于300g 4℃ 富集離心5min后移去上清（清洗一次），添加1ml左右原代培養緩沖液 B轉移到1.5mlEP管，重新重懸離心（清洗二次）。
 
4、類器官操作流程——離心、加膠
 

基質膠計算：第3步后觀察收集到的組織體積，添加25倍組織體積的基質膠重懸鋪板（金屬冰盒或冰上操作）。
 

5、類器官操作流程——點膠、加液
 

以24孔細胞培養板為例，每孔點膠25ul組織基質膠混合物進行鋪板（金屬冰盒或冰上操作），將鋪好的培養板放入37℃培養箱中10-15min成膠，添加500-750μl 小鼠正常肝類器官培養基 A（恢復室溫）進行培養。

 

 

6、類器官操作流程之——觀察

 

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傳代培養

 

一、類器官傳代培養——樣本收集

 

1、移液器吸去培養基，每孔添加 1-2ml左右4℃類器官傳代培養緩沖液G放置 2min。

2、移液搶輕柔吹打基質膠，收集在 15ml 離心管中，4℃靜置 10min(每 6-8 孔為一組) 。

 

二、類器官傳代培養——樣本消化

1、類器官數量不足或體積較小時：300g 4℃ 離心 5min 棄去上清，添加1ml類器官傳代培養緩沖液 G重懸移入 1.5ml 離心管，300g4℃ 離心 5min（如圖5）棄去液體進行第3步。

2、類器官數量較多或體積較大時：300g 4℃ 離心 5min 棄去上清，添加適量類器官傳代消化液 D（是類器官懸液的1-2倍）超凈臺內消化 2-3min（中間可以吹打1-2次）（如圖6） ，添加適量類器官傳代培養緩沖液 G（緩沖液G：傳代消化液D=5:1）終止消化，300g 4℃ 離心 5min 棄去上清，添加1ml類器官傳代培養緩沖液 G重懸移入 1.5ml（ 如圖7） 離心管，300g 4℃ 離心 5min 棄去液體進行第3步。（如圖4）

 

 

三、類器官傳代培養——鋪板
 

類器官收集后，添加25倍基質膠重懸（基質膠體積：細胞沉淀體積=25:1），每孔25μl（如圖8） 基質膠鋪在 24孔細胞培養板中，放置培養箱中 10-15min 添加 500μl-750ul（如圖9）小鼠正常肝類器官培養基 A。

 

四、類器官傳代后增殖現象

 

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類器官凍存

 

1、移液器吸去培養基，每孔添加 1-2ml 左右4℃類器官傳代培養緩沖液G放置 2min。

2、移液搶輕柔吹打基質膠，收集在 15ml 離心管中，4℃靜置 10min(每 6-8 孔為一組) 。

3、300g 4℃ 離心 5min 棄去上清，添加1ml類器官傳代培養緩沖液 G重懸移入 1.5ml 離心管，300g4℃ 離心 5min（如圖5）棄去液體。

4、添加適量類器官凍存液 F，輕柔吹打重懸，以24孔細胞培養板為例：密度為2個孔凍存 1管（500個/ml密度凍存），每管體積1.4ml。

5、凍存方法
1）將凍存管放入梯度凍存盒然后保存至-80℃過夜，第二天取出放入液氮罐。

2）4℃冰箱放置30 min，轉移至-20℃放置1 h，最后移至-80℃過夜，第二天取出放入液氮罐。

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類器官復蘇

1、實驗前準備

1）將水浴鍋預熱至37℃；

2）細胞實驗室進行常規消毒，用預防噴霧噴涂并且使用紫外線照射40min的超凈工作臺臺面；

3）在超凈工作臺中按次序擺好消過毒的離心管、吸管、培養板等。

 

2、取出凍存管
 

1）根據細胞凍存記錄按標簽找到所需細胞的編號。

2）從液氮罐中取出凍存盒，取出所需的凍存管，同時核對凍存管外的編號。

 

3、迅速解凍
 

迅速將凍存管投入到已經預熱的水浴鍋中解凍，并要不斷地搖動，使管中地液體迅速融化。約1-2min后凍存管內液體完全溶解，取出用酒精棉球擦拭凍存管地外壁，再拿入超凈臺內。
 

4、將類器官組織液移入15ml離心管，添加類器官傳代培養緩沖液 G 10ml重懸，輕柔吹打混勻，300g 4℃ 離心 5min。

5、棄上清，添加1ml 類器官傳代培養緩沖液 G重懸將沉淀轉移至1.5ml EP管，300g 4℃ 離心 5min，棄去上清。

6、添加25倍基質膠重懸（基質膠體積：細胞沉淀體積=25:1），每孔25μl基質膠鋪在 24孔細胞培養板中，放置培養箱中 10-15min 添加 500μl-750ul 小鼠正常肝類器官培養基 A。

 

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類器官鑒定

 

一、類器官鑒定——類器官收集

 

 

1、類器官收集；

2、清洗1-3遍，洗去大部分基質膠，離心棄去大部分上清。
 

二、類器官鑒定——瓊脂糖凹槽制備

 

三、類器官鑒定——固定

 

四、類器官鑒定——包埋

 

五、類器官鑒定——HE染色