循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）液體活檢是非常活躍的研究領(lǐng)域，且已證明其是微創(chuàng)癌癥檢測(cè)和監(jiān)測(cè)的有力手段。在個(gè)性化疾病監(jiān)測(cè)中，細(xì)胞游離DNA（cfDNA）的表觀遺傳狀態(tài)也正成為一種有前景的生物標(biāo)志物，也可能被證明在癌癥篩查中具有價(jià)值¹。納米孔測(cè)序技術(shù)能準(zhǔn)確靈敏地檢出低豐度的cfDNA和ctDNA^2,3，且可直接從納米孔測(cè)序數(shù)據(jù)中檢測(cè)DNA甲基化，而無(wú)需在樣本制備過(guò)程中進(jìn)行相關(guān)轉(zhuǎn)化或擴(kuò)增。因此此技術(shù)平臺(tái)未來(lái)有望成為“液體活檢的強(qiáng)大工具”^4,5。

此前，意大利佛羅倫薩癌癥研究和預(yù)防機(jī)構(gòu)ISPRO的Martignano團(tuán)隊(duì)，創(chuàng)新地采用Oxford Nanopore納米孔低深度全基因組測(cè)序（WGS）從癌癥液體活檢樣本中檢測(cè)拷貝數(shù)畸變（CNA），并發(fā)表了相關(guān)論文³。在此基礎(chǔ)上，該團(tuán)隊(duì)又與以色列耶路撒冷希伯來(lái)大學(xué)的Katsman團(tuán)隊(duì)開(kāi)展合作。最近他們證明，液體活檢中cfDNA和ctDNA的Oxford Nanopore納米孔低深度全基因組測(cè)序（WGS）技術(shù)還可用于檢測(cè)cfDNA的細(xì)胞起源、癌癥相關(guān)片段標(biāo)記物和癌癥特異性甲基化特征，并且其結(jié)果與短讀長(zhǎng)測(cè)序得到的數(shù)據(jù)集相當(dāng)⁵。Katsman團(tuán)隊(duì)總結(jié)了該平臺(tái)的優(yōu)點(diǎn)：[Oxford Nanopore Technologies]研發(fā)的測(cè)序技術(shù)操作簡(jiǎn)單，一次測(cè)序就可獲得多種特征，測(cè)序儀成本低且便攜，因而在臨床研究領(lǐng)域極具價(jià)值⁵。

利用納米孔測(cè)序檢測(cè)甲基化非常吸引Katsman及其團(tuán)隊(duì)，因?yàn)閬喠蛩釟潲}WGS法存在樣本可能顯著降解和輸入材料損失，并可能難以確定片段規(guī)律等缺點(diǎn)。此外，亞硫酸氫鹽測(cè)序無(wú)法區(qū)分5mC和其他修飾，如5hmC、5fC和5CaC，而這些修飾原則上均可通過(guò)納米孔技術(shù)檢測(cè)到⁵。

Katsman團(tuán)隊(duì)僅基于cfDNA分析，使用納米孔測(cè)序并與對(duì)應(yīng)的短讀長(zhǎng)WGS數(shù)據(jù)集進(jìn)行比較，估計(jì)了其樣本中癌細(xì)胞的比例。為更好理解低測(cè)序深度影響，該團(tuán)隊(duì)進(jìn)行了降采樣實(shí)驗(yàn)，并且證明了當(dāng)納米孔WGS數(shù)據(jù)降采樣至0.2x平均覆蓋深度時(shí)，結(jié)果仍然一致。當(dāng)以更高的深度對(duì)短讀長(zhǎng)文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序時(shí)（中位數(shù)為1.3x），Oxford Nanopore的納米孔測(cè)序得到的腫瘤比例估計(jì)值與短讀長(zhǎng)測(cè)序的結(jié)果極為相似。

他們還證明，Oxford Nanopore納米孔低深度全基因組測(cè)序（WGS）技術(shù)就可再現(xiàn)正常非癌細(xì)胞類型的構(gòu)成，而使用短讀長(zhǎng)亞硫酸氫鹽法（WGBS）則需要更高的測(cè)序深度才能做到。

此外，Katsman團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，腫瘤比例更高的樣本，其片段大小也往往更短，因此，片段長(zhǎng)度差異也可能用于區(qū)分癌癥類型⁵。采用Oxford Nanopore的測(cè)序技術(shù)，可對(duì)短片段進(jìn)行高效測(cè)序，同時(shí)也可比短讀長(zhǎng)測(cè)序法更能捕獲到較長(zhǎng)的cfDNA片段（如Yu等人⁶最近的報(bào)告）。

Katsman團(tuán)隊(duì)指出，雖然樣本規(guī)模小，但他們獲得的結(jié)果顯示，在DNA甲基化、片段化和CAN的癌癥特異性特征方面，納米孔測(cè)序數(shù)據(jù)與短讀長(zhǎng)WGS和WGBS數(shù)據(jù)集之間大體一致。降采樣分析顯示，納米孔測(cè)序所需的基因組覆蓋度（至少0.2x），足以根據(jù)DNA甲基化特征檢測(cè)出所有樣本中癌癥衍生的DNA。

作者們還指出，他們其他相關(guān)工作表明，納米孔測(cè)序樣本制備快，測(cè)序快，可在1-3小時(shí)內(nèi)就對(duì)腫瘤DNA以甲基化為基礎(chǔ)進(jìn)行分類⁵。雖然他們沒(méi)有在自己的研究中測(cè)試過(guò)這種快速測(cè)序方法，但希伯來(lái)大學(xué)的高級(jí)研究員Ben Berman認(rèn)為，這是他們研究基于納米孔技術(shù)的液體活檢的最終目標(biāo)之一，即“在診療現(xiàn)場(chǎng)幾小時(shí)內(nèi)完成全面分析”⁷。

cf DNA測(cè)序：起始樣品<1 ng，無(wú)需PCR

盡管cfDNA分析領(lǐng)域發(fā)展迅速，但每毫升血漿只能提取單納克或更少的cfDNA仍然構(gòu)成一大瓶頸，因?yàn)闇y(cè)序通常需要數(shù)百納克的DNA。為解決這一難題，Lau及其同事們開(kāi)發(fā)了一種無(wú)需PCR和亞硫酸氫鹽的Oxford Nanopore納米孔測(cè)序方法，以有效表征cfDNA的甲基化特征⁸。具體而言，該團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了一系列操作步驟，將樣本條形碼和納米孔測(cè)序接頭有效地融入cfDNA，并系統(tǒng)地優(yōu)化反應(yīng)條件，以最大限度地提高cfDNA文庫(kù)產(chǎn)量。

“用這種無(wú)PCR方法，只需從每份樣本提取納克量或更少的cfDNA就可生成測(cè)序文庫(kù)⁸”

用他們的方法，每份cfDNA樣本可生成多達(dá)數(shù)億讀長(zhǎng)，比現(xiàn)有方法提高了一個(gè)數(shù)量級(jí)。例如，用5 ng DNA可獲得約600萬(wàn)個(gè)已比對(duì)和過(guò)濾的讀長(zhǎng)，用100 pg DNA可獲得約140,000個(gè)比對(duì)讀長(zhǎng)。

他們將其方法用于表征癌癥研究樣本的cfDNA甲基化組，并證明了在治療中使用這些特征進(jìn)行縱向監(jiān)測(cè)的潛力（圖1）。獲得的甲基化特征揭示了特異性治療反應(yīng)和耐藥性轉(zhuǎn)移癌的出現(xiàn)。

作者們?cè)谟懻撍麄儗?duì)本研究的長(zhǎng)期愿景時(shí)得出結(jié)論：“這種方法有可能對(duì)癌癥檢測(cè)和表征的液體活檢診斷產(chǎn)生影響”⁸。

圖1：結(jié)直腸癌研究樣本中cfDNA的縱向甲基化特征。總cfDNA讀長(zhǎng)（上圖）和與對(duì)應(yīng)腫瘤匹配的甲基化特征讀長(zhǎng)（下圖）。第400天后，具有腫瘤特異性甲基化變化的讀長(zhǎng)片段比例顯著增加，這與腫瘤轉(zhuǎn)移進(jìn)展相關(guān)。（圖來(lái)自Lau等人，2022年⁸）

“這項(xiàng)可行性研究表明，Oxford Nanopore低深度WGS技術(shù)可成為液體活檢的有力工具⁵”

參考文獻(xiàn)

1. Klein, EA. et al. Ann Oncol. 32:1167–77 (2021)

2. Marcozzi, A. et al. NPJ Genom Med. 6, 106 (2021)

3. Martignano, F. et al. Molecular Cancer. 20:32 (2021)

4. Yuen, ZW-S. et al. Nat Commun. 12:3438 (2021)

5. Katsman, E. et al. Genome Biology. 23:158 (2022)

6. Yu, SCY. et al. Proc Natl Acad Sci USA. 118. (2021)

7. Berman, B. Personal communication with Oxford Nanopore Technologies on 23 August 2022

8. Lau, BT. et al. bioRxiv. 497080 (2022)

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