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RT-PCR操作步驟及提高RT-PCR反應體系靈敏度方法

瀏覽次數:1401 發布日期:2021-12-27  來源:本站 僅供參考,謝絕轉載,否則責任自負

RT-PCR,全稱反轉錄聚合酶鏈反應(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)是將RNA的反轉錄和cDNA的聚合酶鏈式擴增(PCR)相結合的技術。

實驗原理是在試管內,以變性-退火-延伸三個基本反應為一個循環,反復重復這種循環,使DNA得以擴增。其目的是檢測核酸的表達,主要是RNA的表達,DNA不需要反轉錄的過程,直接PCR檢測即可。

RT-PCR操作步驟:

1. RNA抽提
方法:TRlzol法。
主要成分:苯酚(具有裂解細胞和變性蛋白的作用)。
RNA抽提前準備:試劑耗材準備(注意RNase free)、樣品的準備。
步驟:樣品+1ml TRlzol室溫裂解10min+200μL氯仿振蕩30s后室溫靜置2-3 min;4℃低溫離心(12 000g×20min);400μL上層水相+600μL異丙醇室溫沉淀10min;4℃低溫離心(12 000g×20min);75%乙醇沖洗;晾干沉淀,DEPC-treated水溶解。

2. RNA 質量檢測
方法:分光光度計測定、凝膠電泳法

3. 反轉錄
是以RNA為模板合成cDNA的過程。在這個過程中遺傳信息的流動方向和轉錄時相反,所以稱為“反轉錄”。在這個過程中需要一個反轉錄酶,合成的DNA稱為與RNA互補的DNA(complementary DNA, cDNA)。這個過程中根據不同的情況選擇不同的反轉錄引物,如果要檢測的RNA有poly A尾巴,可以用Oligo(dT)做反轉錄引物;如果要檢測的RNA沒有poly A尾巴,就用隨機引物(random primer)來反轉;如果要檢測的RNA序列已知,可用特定引物(specific primer)來反轉。
 


提高RT-PCR反應體系的靈敏度​:

1、分離高質量RNA

成功的cDNA合成來自高質量的RNA。高質量的RNA應保證全長并且不含逆轉錄酶的抑制劑如EDTA或SDS等,以及盡可能減少基因組DNA污染。RNA的質量決定了你能夠轉錄到cDNA上的序列信息量的大值。
 
2、使用無RNaseH活性的逆轉錄酶
在逆轉錄反應中經常加入RNase抑制劑以增加cDNA合成的長度和產量。不管是M-MLV還是AMV,在本身的聚合酶活性之外,都具有內源RNaseH活性。RNaseH活性同聚合酶活性相互競爭RNA模板與DNA引物或cDNA延伸鏈間形成的雜合鏈,并降解RNA:DNA復合物中的RNA鏈。被RNaseH活性所降解的RNA模板不能再作為合成cDNA的有效底物,降低了cDNA合成的產量和長度。因此消除或大大降低逆轉錄酶的RNaseH活性將會大有裨益。
 
3、提高逆轉錄保溫溫度
較高的保溫溫度有助于RNA二級結構的打開,增加了反應的產量。對于多數RNA模板,在沒有緩沖液或鹽的條件下,將RNA和引物在65℃保溫,然后迅速置于冰上冷卻,可以消除大多數二級結構,從而使引物可以結合。
 
4、促進逆轉錄的添加劑
包括甘油和DMSO在內的添加劑加到*鏈合成反應中,可以減低核酸雙鏈的穩定并解開RNA二級結構,多可以加入20%的甘油或10%的DMSO而不影響SuperScriptⅡ或M-MLV的活性。AMV也可以耐受多20%的甘油而不降低活性。
 
5、RNaseH處理 

在PCR之前使用RNaseH處理cDNA合成反應可以提高靈敏度。對于某些模板,在cDNA合成反應中的RNA會阻止擴增產物的結合,在這種情況下,RNaseH處理可以增加靈敏度。一般當擴增較長的全長cDNA目標模板時,RNaseH處理是必需的,比如低拷貝的tuberous scherosisⅡ。對這種困難模板,RNaseH的處理加強了SuperScriptⅡ或AMV合成的cDNA所產生的信號。對于多數RT-PCR反應,RNaseH處理是可選的,因為95℃保溫的PCR變性步驟一般會將RNA:DNA復合物中的RNA水解掉。
 
6、小量RNA檢測方法的提高 
當僅有小量RNA時,RT-PCR尤其具有挑戰性。在RNA分離過程中加入的作為載體的糖元有助于增加小量樣品的產量。可以在加入Trizol的同時加入無RNase的糖元。對于小于50mg的組織106個培養細胞的樣品,無RNase糖元的建議濃度為250μg/ml。在使用SuperScriptⅡ的逆轉錄反應中加入乙酰化BSA可以增加靈敏度,而且對于小量RNA,減少SuperScriptⅡ的量并加40單位的RnaseOut核酸酶抑制劑可以提高檢測的水平。如果在RNA分離過程中使用了糖元,仍然建議在使用SuperScriptⅡ進行逆轉錄反應時加入BSA或RNase抑制劑。
 
7、減少基因組DNA污染
RT-PCR所遇到的一個潛在的困難是RNA中有基因組DNA污染,可以在逆轉錄之前使用擴增級的DNaseⅠ對RNA進行處理以除去沾染的DNA。將樣品在2.0mM EDTA中65℃保溫10分鐘以終止DNaseⅠ消化。EDTA可以螯合鎂離子,防止高溫時所發生的依賴于鎂離子的DNA水解。為了將擴增的cDNA同沾染的基因組DNA擴增產物分開,可以設計分別同分開的外顯子退火的引物。來源于cDNA的PCR產物會比來源于污染的基因組DNA的產物短。另外對每個RNA模板進行一個無逆轉錄的對照實驗,以確定一個給定片段是來自基因組DNA還是cDNA。在無逆轉錄時所得到的PCR產物來源于基因組。

發布者:上海博湖生物科技有限公司銷售部
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