液滴微流控（六）：單細(xì)胞高通量液滴測序（Drop-seq）
細(xì)胞是生物結(jié)構(gòu)與功能的基本單位，形態(tài)類型千差萬別。通過細(xì)胞基因組學(xué)，可以描述細(xì)胞特性及功能，本文所介紹的單細(xì)胞（single-cell）高通量液滴測序（Drop-seq）技術(shù)，是一種快速分析成千上萬個單細(xì)胞的方法，通過將每個細(xì)胞包裹在納升級微滴中，進(jìn)行RNA雜交并生成mRNA轉(zhuǎn)錄物，制作細(xì)胞基因表達(dá)譜，進(jìn)一步可分析mRNA轉(zhuǎn)錄物的起源細(xì)胞。
原理簡述
Drop-Seq基于液滴微流控技術(shù)，首先，將細(xì)胞懸浮液與帶有分子條形碼的微珠懸浮液泵至微流控芯片，匯聚并形成層流，之后再與油相匯聚，形成單分散的微滴，將每個細(xì)胞與一個微珠一同包裹于同一微滴中，隨后完成RNA雜交并裂解微滴，釋放mRNA雜交物，完成逆轉(zhuǎn)錄，最后，以PCR方式完成核酸擴(kuò)增，并進(jìn)行測序分析。
測序過程
1.準(zhǔn)備材料：從組織中分離細(xì)胞，制備細(xì)胞懸浮液；制備帶有分子條形碼的微珠懸浮液。
2.制備微滴：將細(xì)胞懸浮液與微珠懸浮液泵至芯片，再與油相匯聚形成單分散的微滴，將每個細(xì)胞與一個微珠一同包裹于同一微滴中。
3.RNA雜交：裂解微滴中的細(xì)胞，細(xì)胞釋放mRNA，與微珠上的分子條形碼雜交。
5. PCR擴(kuò)增：在核酸外切酶的作用下，將每條mRNA逆轉(zhuǎn)錄物“切下”，并以PCR方式進(jìn)行核酸擴(kuò)增，以放大基因信息。
6.測序分析：使用各種生物信息學(xué)工具進(jìn)行測序分析。
液滴測序系統(tǒng)配置
液滴測序系統(tǒng)主要組件：
1.三個Flow EZ壓力泵或一個MFCS EZ壓力泵（四通道）。
2.三個流量監(jiān)測傳感器。
3.一個數(shù)字高速顯微鏡。
4.液滴測序微流控芯片。
Drop-Seq，其應(yīng)用遠(yuǎn)不止對細(xì)胞形態(tài)類型的識別。目前，基因組遺傳學(xué)研究正在研究識別許多導(dǎo)致疾病風(fēng)險的基因，但生物學(xué)缺乏類似液滴測序的高通量基因識別方法，此外，將液滴測序與突變、病原體刺激等微擾動相結(jié)合，可以對多種細(xì)胞進(jìn)行一個信息豐富的、多維度的解讀，揭示微擾動對細(xì)胞的影響。
參考文獻(xiàn)：
[1]. Macosko E , Basu A , Satija R , et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets[J]. Cell, 2015, 161(5):1202-1214.
原理簡述
Drop-Seq基于液滴微流控技術(shù)，首先，將細(xì)胞懸浮液與帶有分子條形碼的微珠懸浮液泵至微流控芯片，匯聚并形成層流，之后再與油相匯聚，形成單分散的微滴，將每個細(xì)胞與一個微珠一同包裹于同一微滴中，隨后完成RNA雜交并裂解微滴，釋放mRNA雜交物，完成逆轉(zhuǎn)錄，最后，以PCR方式完成核酸擴(kuò)增，并進(jìn)行測序分析。
測序過程1.準(zhǔn)備材料：從組織中分離細(xì)胞，制備細(xì)胞懸浮液；制備帶有分子條形碼的微珠懸浮液。
2.制備微滴：將細(xì)胞懸浮液與微珠懸浮液泵至芯片，再與油相匯聚形成單分散的微滴，將每個細(xì)胞與一個微珠一同包裹于同一微滴中。
3.RNA雜交：裂解微滴中的細(xì)胞，細(xì)胞釋放mRNA，與微珠上的分子條形碼雜交。
4.逆轉(zhuǎn)錄：裂解微滴，釋放mRNA雜交物，開始逆轉(zhuǎn)錄，以形成mRNA逆轉(zhuǎn)錄物（STAMPS）。
5. PCR擴(kuò)增：在核酸外切酶的作用下，將每條mRNA逆轉(zhuǎn)錄物“切下”，并以PCR方式進(jìn)行核酸擴(kuò)增，以放大基因信息。6.測序分析：使用各種生物信息學(xué)工具進(jìn)行測序分析。
為什么用液滴微流控？
液滴微流控將微體積樣本快速分離，可實現(xiàn)成千上萬個細(xì)胞的平行高通量分析，通常情況下，每秒可產(chǎn)生1000個微滴，每個微滴的體積為1nL，因此在試劑量上來講，成本將成千倍的降低，此外，其實驗過程無需用到流式熒光細(xì)胞儀等高端儀器，操作簡單、快捷。
液滴微流控將微體積樣本快速分離，可實現(xiàn)成千上萬個細(xì)胞的平行高通量分析，通常情況下，每秒可產(chǎn)生1000個微滴，每個微滴的體積為1nL，因此在試劑量上來講，成本將成千倍的降低，此外，其實驗過程無需用到流式熒光細(xì)胞儀等高端儀器，操作簡單、快捷。
液滴測序芯片圖解液滴測序系統(tǒng)配置液滴測序系統(tǒng)主要組件：1.三個Flow EZ壓力泵或一個MFCS EZ壓力泵（四通道）。
2.三個流量監(jiān)測傳感器。
3.一個數(shù)字高速顯微鏡。
4.液滴測序微流控芯片。
Drop-Seq，其應(yīng)用遠(yuǎn)不止對細(xì)胞形態(tài)類型的識別。目前，基因組遺傳學(xué)研究正在研究識別許多導(dǎo)致疾病風(fēng)險的基因，但生物學(xué)缺乏類似液滴測序的高通量基因識別方法，此外，將液滴測序與突變、病原體刺激等微擾動相結(jié)合，可以對多種細(xì)胞進(jìn)行一個信息豐富的、多維度的解讀，揭示微擾動對細(xì)胞的影響。
參考文獻(xiàn)：
[1]. Macosko E , Basu A , Satija R , et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets[J]. Cell, 2015, 161(5):1202-1214.
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