銳賽小課堂技術篇0626-108
一、實驗流程（1和2為并列步驟）

1.慢病毒過表達質粒載體的構建
設計上下游特異性擴增引物，同時引入酶切位點，PCR(采用高保真KOD酶，3K內突變率為0%)從模板中（CDNA質粒或者文庫）調取目的基因CDS區（coding sequence）連入T載體。將CDS區從T載體上切下，裝入慢病毒過表達質粒載體。
2.慢病毒干擾質粒載體的構建
合成siRNA對應的DNA頸環結構，退火后連入慢病毒干擾質粒載體
3. 慢病毒載體的包裝與濃縮純化
制備慢病毒穿梭質粒及其輔助包裝原件載體質粒，三種質粒載體分別進行高純度無內毒素抽提，共轉染293T細胞，轉染后6 h 更換為完全培養基，培養24和48h后，分別收集富含慢病毒顆粒的細胞上清液，病毒上清液通過超離心濃縮病毒。
二、實驗材料
2.1慢病毒載體、包裝細胞和菌株
該病毒包裝系統為三質粒系統，組成為pspax2, pMD2G, pLVX-IRES-ZsGreen1/pLVX-shRNA2。其中質粒上的ZsGreen1表達框能表達綠色熒光蛋白（GFP）。
載體信息
1) 慢病毒克隆載體圖譜如下：

2） 包裝質粒信息如下：
PMD2G載體圖譜和序列信息

PSPAX2載體圖譜和序列信息：

細胞株 293T，慢病毒的包裝細胞，為貼壁依賴型成上皮樣細胞，生長培養基為DMEM(含10% FBS)。貼壁細胞經培養生長增殖形成單層細胞。 菌株大腸桿菌菌株DH5α。用于擴增慢病毒載體和輔助包裝載體質粒。

三、流程圖

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