第三代高通量測序技術簡介--納米孔
第一代Sanger法為DNA測序打開了大門，但它高昂的費用限制了在大規(guī)模測序工程上的使用。當今發(fā)展迅猛的第二代高通量測序設備，包括Illumina的Solexa、Roche 454系列以及ABI的SOLiD系統(tǒng)等，使測序費用大幅降低到60-1美元/megabase。 它們共同的缺點是每條讀出的DNA序列太短，大致在35-250之間，使得后續(xù)的裝配工作困難重重。
現(xiàn)今，第三代測序設備也初露端倪。基于一個納米級大小微孔的設備在將來有可能成為高通量、廉價且能得到較長DNA序列的單分子測序方法。納米孔嚴格限制了DNA單鏈可以通過的空間，每次只允許一個核苷酸按照原有的次序通過。DNA分子通過納米孔時，它們的序列會被逐一分辨出。整個過程無需繁瑣的增擴、標示步驟。
圖一
納米孔測序使用DNA合成和光學識別技術。目標DNA被轉(zhuǎn)化為較長的單鏈，每個原有的核苷酸被連續(xù)12次復制到新鏈上。經(jīng)過雜交后形成雙鏈結(jié)構(gòu)，進入納米孔前，其中一條鏈將被剝離。可用于制作納米孔的材料比如氮化硅的厚度超過DNA分子的10-100倍，這就可能在同一時間內(nèi)有1個以上的核苷酸在隧道內(nèi)，引起互相干擾無法讀出正確的數(shù)據(jù)。因此有必要在新鏈上多次復制同一個核苷酸。
荷蘭Kavli Institute of Nanoscience開發(fā)出厚度僅為一個原子的新材料（graphene），是否能投入實際使用有待于進一步檢驗。
圖二
每個納米微孔的開閉由離子震蕩控制，α-溶血素明確地分辨出微孔是否有DNA分子（圖二 紅色部分）。DNA鏈進入微孔的速率由電壓調(diào)節(jié)。
圖三 A 圖三 B
核酸外切酶依附到α-溶血素的頂部（圖三B 淺藍色部分），持續(xù)地從單鏈上切割下堿基（金色）。單個堿基通過微孔內(nèi)的氨基化環(huán)糊精（紅色）時，它們的遺傳符號（A，T，G或C）被逐一讀出。幾毫秒后，堿基穿過了整個納米孔，到達雙分子膜的另一端（圖三 A）。
圖四
橫截面的電流探測遺傳符號。核苷酸通過隧道時其自身的極性改變了原有的電磁場，由此探測器得知每個具體的遺傳符號（圖四）。4種核苷酸不同的結(jié)構(gòu)賦予它們不同的電子特征，這是最初納米孔測序的理論基礎。
除了材料方面的問題外，納米孔測序還有下列的難題有待于解決：
1. 控制核酸外切酶精確的切割DNA分子。
2. 如何實現(xiàn)對長DNA序列的測序。
3. 控制堿基在納米孔內(nèi)的移動。
4. 納米孔的穩(wěn)定性和可靠性。
在過去的幾年里，第二代測序技術為基因研究做出了杰出的貢獻，但是他們普遍存在長度和質(zhì)量上的缺陷。為實驗設計，數(shù)據(jù)分析和應用帶來了不便。第三代測序技術有望克服以上的缺點。測序費用的降低使得過去只有大型研究機構(gòu)才能開展的測序工作如今也可在普通的實驗室進行。技術進步將會帶來更多的方法，推動人類疾病治療向前發(fā)展。
參考文獻：
1. The potential and challenges of nanopore sequencing. volume 26 number 10 OCTOBER 2008 nature biotechnology.
2. DNA Translocation through Graphene Nanopores. Gregory F. Schneider, Stefan W. Kowalczyk, Victor E. Calado, Gregory Pandraud, Henny W. Zandbergen, Lieven M. K. Vandersypen, and Cees Dekker. Nano Lett., 2010, 10 (8), pp 3163–3167
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wch888 (27.115.111.122)
不錯。。。
2013-4-2 13:26:00
不錯。。。
2013-4-2 13:26:00
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