（一）什么是3d懸浮細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，定義？
3D懸浮細胞培養(yǎng)系統(tǒng)是一種先進的體外細胞培養(yǎng)技術，其核心在于無需固體支架或基質附著，直接在動態(tài)懸浮的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞。在該系統(tǒng)中，細胞通過自組裝或特定培養(yǎng)條件（如微載體、低粘附表面、旋轉生物反應器、懸滴法、磁懸浮，北京基爾比生物科技公司研制生產的3d懸浮細胞培養(yǎng)系統(tǒng)等）形成三維（3D）聚集體、球狀體（Spheroids）或類器官（Organoids）。與傳統(tǒng)單層（2D）貼壁培養(yǎng)相比，它還原了細胞在活體組織中的三維空間結構、細胞間相互作用以及微環(huán)境信號，是構建更接近生理狀態(tài)的體外模型的革命性技術。

1.  模擬體內三維微環(huán)境與細胞間相互作用：
細胞在三維空間中自由生長、遷移和相互作用，形成復雜的細胞-細胞連接和細胞外基質網絡。這種結構直接影響細胞的基因表達、信號傳導、分化和功能，使其行為（如增殖、代謝、藥物反應）更接近體內真實情況。

2.  支持復雜組織結構形成與功能表達：
系統(tǒng)能促進細胞自組織形成具有空間異質性的結構，如腫瘤球體（模擬實體瘤的缺氧核心和增殖外層）、肝細胞球體（形成類似膽管的結構）、神經球（形成神經網絡）以及高度復雜的類器官（如迷你腸、腎、腦等）。這些結構能更好地展現源組織的特定功能（如藥物代謝、屏障功能、電信號傳導）。

3.  提供動態(tài)培養(yǎng)環(huán)境：
  通過攪拌、旋轉或灌注等方式，例如北京基爾比生物科技公司研制生產的3d懸浮細胞培養(yǎng)系統(tǒng)可實現對培養(yǎng)基的持續(xù)混合，確保營養(yǎng)物質和氧氣的均勻分布，并及時清除代謝廢物。這種動態(tài)環(huán)境比靜態(tài)培養(yǎng)更能模擬體內的流體剪切力和物質交換，尤其適用于模擬血管化組織或研究流體力學對細胞的影響（如內皮細胞）。

4.  實現高通量篩選與分析：
  形成的3D球狀體或小聚集體大小相對均一，非常適合在微孔板中進行自動化操作和高通量應用，如藥物篩選、毒性測試、基因功能研究。其生理相關性遠高于2D模型，能提供更可靠的預測數據。

5.  適用于規(guī)模化培養(yǎng)與特定細胞類型：
懸浮培養(yǎng)模式易于在Kirkstall Quasi Vivo 3D活細胞自動灌注動態(tài)構建培養(yǎng)系統(tǒng)中放大規(guī)模，用于生產細胞治療產品（如干細胞、免疫細胞）或生物制品（如病毒、重組蛋白）。尤其適合本身在體內就是懸浮生長的細胞（如血液細胞、某些腫瘤細胞）或難以貼壁的細胞（如多能干細胞）。

北京基爾比生物科技公司研制生產的【3D懸浮細胞培養(yǎng)系統(tǒng)】通過提供無支架的三維動態(tài)環(huán)境，核心功能在于突破性地模擬體內組織的復雜結構與微環(huán)境，使體外培養(yǎng)的細胞展現出更真實的生理和病理行為。它在基礎研究（發(fā)育、疾病機制）、藥物研發(fā)（高通量篩選、毒性預測、個性化醫(yī)療）、再生醫(yī)學（類器官、細胞治療）等領域正迅速成為的強大工具，顯著提升體外模型的預測價值和生理相關性。

（二）北京基爾比生物公司三維懸浮細胞培養(yǎng)案例分析

通過3D懸浮微培養(yǎng)技術，將成年患者的皮膚成纖維細胞直接重編程為功能性神經元，并展示了這些神經元在體外和體內實驗中的穩(wěn)定性和功能性。這項技術為神經退行性疾病的細胞替代療法和疾病建模提供了新的可能性。

試驗步驟

細胞準備

從皮膚活檢中獲取成年皮膚成纖維細胞（hDFs），并進行培養(yǎng)。

- hDFs培養(yǎng)于T175培養(yǎng)瓶中，使用未涂覆的培養(yǎng)瓶以避免細胞貼壁。

- 細胞在37°C、5% CO₂下培養(yǎng)。

細胞傳代

當細胞達到90%匯合時，使用0.05%胰蛋白酶在D-PBS中傳代。

- 傳代比例根據實驗需求調整。

- 傳代后的細胞可用于后續(xù)的重編程實驗或冷凍保存。

細胞重編程準備

將hDFs重懸于含有慢病毒的培養(yǎng)基中，準備進行3D培養(yǎng)。

- 使用超低吸附表面的錐形微孔板（如Elplasia板或Costar U型底微孔板）。

- 根據所需細胞球大小選擇合適的微孔板。

3D細胞球形成

將細胞與慢病毒混合后，接種到微孔板中，通過離心使細胞均勻分布于微孔中。

- 離心條件：24小時，100g。

- 細胞在24小時內自組裝成球形結構。

細胞球培養(yǎng)

在特定的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞球，促進成纖維細胞向神經元的轉化。

- 培養(yǎng)基：NDiff227，補充以下成分：早期神經誘導培養(yǎng)基（第0-16天） CHIR99021：2 μM SB431542：10 μM Noggin：0.5 μg/ml LDN1931189：0.5 μM VPA：1 mM LM22A4：2 μM GDNF：2 ng/ml NT3：10 ng/ml db-cAMP：0.5 mM 晚期神經誘導培養(yǎng)基（第16天后） LM22A4：2 μM GDNF：2 ng/ml NT3：10 ng/ml db-cAMP：0.5 mM

- 細胞球在培養(yǎng)期間保持空間分離，避免融合。

細胞球收獲與移植

在培養(yǎng)一定時間后，輕輕收獲細胞球，用于移植或其他實驗。

- 使用玻璃毛細管進行移植，確保細胞球的完整性。

- 移植時避免對細胞球進行酶解或機械分離。

功能驗證

對重編程后的神經元進行功能驗證，包括電生理記錄、鈣成像和多巴胺釋放檢測。

- 電生理記錄：使用全細胞膜片鉗技術，記錄細胞的動作電位和離子電流。

- 電生理記錄和鈣成像實驗在培養(yǎng)60天后進行。

體內移植實驗

將3D培養(yǎng)的神經元移植到成年大鼠的大腦中，評估其存活、成熟和功能整合。

- 移植部位：大鼠背外側紋狀體。

- 移植的細胞球大小為2000細胞/球，使用150 μm內徑的玻璃毛細管進行移植。

預期研究成果

• 3D培養(yǎng)的優(yōu)勢：3D懸浮培養(yǎng)技術提供了一個有利于神經元轉化和長期存活的環(huán)境，克服了2D培養(yǎng)中細胞附著和機械應激的問題。

• 功能性神經元的生成：通過3D培養(yǎng)技術，研究者能夠生成具有功能性突觸和神經遞質釋放能力的神經元。

• 體內移植的成功：3D培養(yǎng)的神經元在移植到成年大鼠大腦后能夠存活、成熟并整合到宿主神經回路中，這為未來的細胞替代療法提供了希望。

• 疾病建模和再生醫(yī)學的應用潛力：這種3D培養(yǎng)技術為研究神經退行性疾病和開發(fā)新的治療方法提供了新的工具。

北京基爾比生物科技公司的【3d懸浮微重力細胞培養(yǎng)系統(tǒng)】的優(yōu)勢在于多功能集成與實時監(jiān)控能力。設備內置傳感器，可實時監(jiān)控并可視化重力水平；旋轉器主體緊湊設計可放入標準CO2培養(yǎng)箱，維持細胞培養(yǎng)的溫濕度和氣體環(huán)境。

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