脂多糖 (LPS) 在炎癥造模中的應(yīng)用
LPS 何方神圣？在體內(nèi)如何誘發(fā)炎癥反應(yīng)？
如何選擇 LPS 構(gòu)建"合拍"的炎癥疾病模型？
來來來，一起了解下！
Section.01
LPS 與炎癥發(fā)生
噓，可不要小瞧了它！脂多糖 (Lipopolysaccharide；LPS) ，是由脂質(zhì)和多糖組成的大分子，廣泛存在于革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁中，又被稱為內(nèi)毒素，它可是具有強(qiáng)烈的促炎性質(zhì)[1]。
LPS 結(jié)構(gòu)
LPS 是由脂質(zhì) A、核心多糖和 O-特異性抗原組成。包含這三個組分的為光滑型 S-LPS，缺乏 O 抗原的則被稱為粗糙型 R-LPS，或脂寡糖 (LOS)[2]。
圖 1. LPS 的經(jīng)典結(jié)構(gòu)[2]。• 脂質(zhì) A：LPS 的脂質(zhì)部分，嵌在細(xì)菌外膜的磷脂層中，是內(nèi)毒素的主要毒性成分。不同革蘭氏陰性菌的脂質(zhì) A 結(jié)構(gòu)具有一定差異，但在同一菌株中結(jié)構(gòu)基本相同。脂質(zhì) A 的任何結(jié)構(gòu)變化都可能改變 LPS 的免疫效力并決定其毒性。此外，脂質(zhì) A 對于宿主受體的特異性識別非常重要，能夠刺激宿主的免疫反應(yīng)[2]。
• 特異性抗原：由多個寡糖重復(fù)單位組成，位于 LPS 的最外層，是 LPS 中變化最大的部分。O-特異性抗原的糖殘基種類、長度、排列順序和連接方式具有菌株特異性，決定了細(xì)菌的抗原特異性[2]。根據(jù) O 抗原的差異可將大腸桿菌分為不同的血清群，如 O55、O111 等。
• 核心多糖：連接了 O-特異性抗原和脂質(zhì) A。由庚糖、半乳糖等組成，結(jié)構(gòu)相對保守[2]。
LPS 誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)
LPS 與 TLR4
TLR4：Toll 樣受體 4，可在單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞等髓樣細(xì)胞中表達(dá)，是重要的細(xì)胞表面模式識別受體，負(fù)責(zé)啟動和維持宿主的炎癥反應(yīng)[2]。
LPS 主要通過其經(jīng)典受體 Toll 樣受體 4 (TLR4) 誘導(dǎo)強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)。LPS 進(jìn)入宿主體內(nèi)，會與 LPS 結(jié)合蛋白 (LBP) 結(jié)合，然后進(jìn)一步與細(xì)胞膜上的 CD14 (CD14 是很多免疫細(xì)胞的 GPI 錨定膜蛋白) 結(jié)合，形成 CD14-LPS 復(fù)合物。這一結(jié)合過程促使 LPS 與 TLR4-MD2 復(fù)合物相互作用，進(jìn)而激活細(xì)胞內(nèi)的信號通路[2][3]。
圖 2. LPS 作用機(jī)制[2]。
細(xì)胞內(nèi) LPS/TLR4 下游信號傳導(dǎo)主要分為兩類，MyD88 依賴性通路和 TRIF 依賴性通路。它們分別介導(dǎo)促炎細(xì)胞因子和 I 型干擾素基因的激活[2][4]。
• 在 MyD88 依賴性通路中：活化的 MyD88 可募集并激活 IRAK4、IRAK1 和 IRAK2，接著與 TRAF6 發(fā)生相互作用。進(jìn)一步激活 TAK1-TAB1 復(fù)合物，刺激 IKKα/IKKβ 復(fù)合物，然后誘導(dǎo) NF-κB 等轉(zhuǎn)錄因子核轉(zhuǎn)位，啟動炎癥細(xì)胞因子基因的轉(zhuǎn)錄，促使細(xì)胞釋放如 IL-1β、IL - 6、TNF-α 等多種炎癥細(xì)胞因子。
• 在 TRIF 介導(dǎo) MyD88 非依賴性通路中：TRIF 通過招募 TRAF3 可激活 IRF3，然后，IRF3 與 IRF7 形成同源或異源二聚體，進(jìn)而轉(zhuǎn)錄 IFN 和 IFN 誘導(dǎo)型基因，誘導(dǎo) IFN-α 和 IFN-β 釋放。同時，TRIF 也可以通過招募 TRAF6 激活 NF-κB。此外，除了經(jīng)典的 LBP-CD14-TLR4 途徑外，LPS 還可以通過 Caspase 途徑和 TRP 通道等激活免疫細(xì)胞。
總之，上述因素都可以促進(jìn)炎癥信號并引起免疫反應(yīng)。
Section.02
LPS: 炎癥造模好幫手
通過前面的介紹，我們了解了 LPS 的定義以及它如何通過復(fù)雜的信號通路激活細(xì)胞內(nèi)的炎癥反應(yīng)。鑒于 LPS 具備強(qiáng)大的促炎特性，這使其成為我們構(gòu)建誘導(dǎo)炎癥模型的得力助手！
首先，解答大家在選購 LPS 時的一個小疑惑！
MCE 網(wǎng)站為啥子有十幾種 LPS？它們名字后長長長長長長的后綴是什么？
前面我們提到，LPS 是細(xì)菌細(xì)胞壁的成分。So，MCE 網(wǎng)站上不同的 LPS 代表它們來自于不同的細(xì)菌。
小貼士：
舉個例子，我們在誘導(dǎo)炎癥模型中常用的 LPS, from E. coli O55: B5，它是來自于大腸桿菌 O55: B5 血清型的內(nèi)毒素。其中，大腸桿菌血清型是大腸桿菌的一種分類方式，O55 代表了特異性 O 鏈中 O 抗原的一種特定類型，B5 表示鞭毛抗原的一種類型。
下面，我們就一起了解一下 LPS 可以誘導(dǎo)哪些模型以及一些注意事項~
一、體外細(xì)胞炎癥模型[5][6][7][8]
1. 推薦的 LPS 類型 (排名有先后順序哦~)：
1) Lipopolysaccharides, from E. coli O55: B5 (廣泛使用！)；
2) Lipopolysaccharides, from E. coli O111: B4 (廣泛使用！)；
3) Lipopolysaccharides, from P. gingivalis (牙周炎相關(guān)研究)。
2. 常用細(xì)胞類型：
1) 巨噬細(xì)胞，如 RAW 264.7、BMDMs；
2) 小膠質(zhì)細(xì)胞，如 N9、原代細(xì)胞；
3) 腫瘤細(xì)胞，如 Caco-2、A549 和 PC3。
3. 參考濃度范圍和處理時間：
0.1-10 μg/mL；1-24 h。
4. 推薦檢測指標(biāo)：
1) 上清或細(xì)胞中炎癥因子：IL-1β、IL-6 及 TNF-α 等 (ELISA/qPCR/WB)；
2) NO 釋放/NO 代謝物含量 (Kits 檢測)；
3) 炎癥基因：iNOS、NF-kB 及 NLRP3 等 (qPCR/WB)；
4) 細(xì)胞活力：CCK-8 或 MTT。
5. 注意事項：
1) 在正式實驗前，應(yīng)根據(jù)細(xì)胞系和 LPS 來源等查找相關(guān)參考文獻(xiàn)，進(jìn)行濃度和時間梯度的篩選以確定最優(yōu)的實驗方案。
2) LPS 刺激細(xì)胞不一定會引起細(xì)胞死亡，因此不宜僅僅通過檢測細(xì)胞活力來確定 LPS 造模濃度和時間，建議檢測炎癥因子的表達(dá)和分泌。
3) 在 LPS 刺激細(xì)胞的過程中，應(yīng)定期觀察細(xì)胞的形態(tài)變化，過高濃度可能引發(fā)細(xì)胞毒性，過低濃度則可能無法有效損傷細(xì)胞。
4) 一定濃度的 DMSO 可顯著抑制 LPS 誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，建議用 PBS 或 ddH2O 溶解。
5) 在體外炎癥模型構(gòu)建研究中，Lipopolysaccharides, from E. coli O55: B5 和 Lipopolysaccharides, from E. coli O111: B4 是應(yīng)用最為廣泛的 LPS，推薦使用！若開展牙周炎相關(guān)研究時，也可選用 Lipopolysaccharides, from P. gingivalis。
二、體內(nèi)動物模型
三、神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究
除了上述常見的 LPS 誘導(dǎo)的炎癥疾病模型外，LPS 還可用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究。
圖 2. LPS 作用機(jī)制[2]。
注意事項：
1) 在 LPS 誘導(dǎo)動物模型前，應(yīng)根據(jù)實驗?zāi)康摹游镱愋偷龋檎蚁嚓P(guān)參考文獻(xiàn)，進(jìn)行預(yù)實驗，以確定最優(yōu)的實驗方案。
2) 在 LPS 給藥后，不同的炎癥因子，其含量峰值出現(xiàn)的時間點(diǎn)可能不一致，建議根據(jù)參考文獻(xiàn)確定實驗方案，以及預(yù)實驗時應(yīng)多選幾個時間點(diǎn)檢測。
3) LPS 溶解后可在 -20℃ 穩(wěn)定保存約一個月，-80℃ 約 6 個月。LPS 需避光保存，并避免反復(fù)凍融。由于內(nèi)毒素具有較強(qiáng)的吸附性，建議儲存于硅烷化容器內(nèi)。如果使用玻璃容器，使用前請確保充分混合，以保證 LPS 完全重新溶解 (若 LPS 濃度超過 1 mg/mL，則對小瓶側(cè)面的吸附可忽略不計)。
Section.03
小結(jié)
寶子們，今天小 M 帶著大家梳理了 LPS 的相關(guān)知識。面對五花八門的 LPS，大家再也不用犯愁啦。希望這些知識能幫助大家輕松拿捏實驗，在炎癥研究領(lǐng)域發(fā)光發(fā)熱！如果覺得這篇 LPS 干貨秘籍有幫助，別忘了點(diǎn)贊、分享哦~
| 產(chǎn)品推薦 |
| Lipopolysaccharides, from E. coli O55:B5 Lipopolysaccharides, from E. coli O55:B5 (HY-D1056)，多用于體外細(xì)胞誘導(dǎo)炎癥模型。 |
| Lipopolysaccharides, from E. coli O111:B4 Lipopolysaccharides, from E. coli O111:B4 (HY-D1056A1)，多用于體內(nèi)動物誘導(dǎo)炎癥模型。 |
| Lipopolysaccharides, from P. gingivalis Lipopolysaccharides, from P. gingivalis (HY-D1056D)，多用于牙周炎相關(guān)研究。 |
| Cell Counting Kit-8 Cell Counting Kit-8 (HY-K0301)，快速、高靈敏度細(xì)胞活性檢測試劑盒。 |
| Nitric Oxide Detection Kit Nitric Oxide Detection Kit (HY-K0318)，NO 檢測試劑盒 (Griess 法)。 |
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