隨著基因治療和疫苗研發(fā)領(lǐng)域的快速興起與發(fā)展，該領(lǐng)域已引起學(xué)術(shù)界和產(chǎn)業(yè)界的廣泛關(guān)注與高度重視。病毒載體作為基因治療和疫苗開(kāi)發(fā)的核心遞送系統(tǒng)，其純化工藝的優(yōu)化關(guān)系到終產(chǎn)品的關(guān)鍵質(zhì)量屬性（Critical Quality Attributes, CQAs）。

在眾多純化技術(shù)中，陰離子交換層析（Anion Exchange Chromatography, AEX）因其良好的選擇性、放大性和操作可控性，已逐步成為主流病毒載體純化工藝的重要組成部分。

目前主流的病毒載體系統(tǒng)主要包括慢病毒（LV）、（γ-）逆轉(zhuǎn)錄病毒（RV）、腺病毒（AdV）和腺相關(guān)病毒（AAV）。以下為整理相關(guān)病毒載體的基本信息，根據(jù)以下信息可推薦合適的純化方案。

目前應(yīng)用最廣泛的病毒載體包括：

病毒載體純化通常包括以下幾個(gè)步驟：

• 細(xì)胞收獲：超速離心（100,000×g/2h），深層過(guò)濾（0.45μm+0.22μm串聯(lián)）。

• 核酸處理：Benzonase（50U/mL，37℃/1h）。

• UF/DF：750KDa/300kDa/100kDa濃縮過(guò)濾。

• 層析純化：陰離子交換是關(guān)鍵步驟

逆轉(zhuǎn)錄病毒是一類具有包膜的單鏈RNA病毒,慢病毒載體是基于人類免疫缺陷病毒1型(HIV-1)改造而成的基因遞送系統(tǒng)，也屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科的重要成員。由于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和慢病毒載體帶負(fù)電荷，所以純化慢病毒的常規(guī)捕獲方法還是以陰離子純化方案為主。

• 填料：Diamond Q 或 Diamond Q Mustang

• 平衡緩沖液：20mM Tris+150mM NaCl，pH7.4

• 洗脫緩沖液：20mM Tris+0.3~0.6M NaCl 梯度洗脫，pH7.4

采用Diamond Layer 400/Layer 700多模式層析填料，在病毒純度和回收率方面表現(xiàn)優(yōu)異。

慢病毒載體的表面電荷異質(zhì)性導(dǎo)致傳統(tǒng)陰離子交換層析存在無(wú)法選擇性捕獲的局限性。針對(duì)這一技術(shù)挑戰(zhàn)，可采用多模式層析填料Diamond Layer 400/Layer 700的創(chuàng)新純化策略，該技術(shù)基于多種層析模式實(shí)現(xiàn)高效純化：

層析方案示例：

• 填料：Diamond Layer 400/Layer 700

• 平衡：20mM Tris+150mM NaCl，pH7.4

• 上樣：電導(dǎo)率<5mS/cm，保留時(shí)間6~10min

• 洗脫：同步收集流穿峰

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

腺病毒為無(wú)包膜的雙鏈DNA病毒，其粒徑較大（~90nm），和逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒載體純化純化方式類似，可使用陰離子層析和多模式層析。

腺相關(guān)病毒（AAV）是一種小型、非包膜的單鏈DNA病毒，屬于細(xì)小病毒科中的依賴病毒屬。其大小為25nm左右，一般還是以根據(jù)表面帶電荷情況去使用陰陽(yáng)離子層析，腺相關(guān)病毒（AAV）的衣殼蛋白的等電點(diǎn)（PI）為5.9~6.3左右，其空殼蛋白雜質(zhì)的PI會(huì)與衣殼蛋白有所差距，去除空殼蛋白一般以高分辨率的陰離子層析為主，可使用Diamond Q Mustang/Q Bestarose HP。

• 填料：Diamond Q Mustang/Q Bestarose HP

• 平衡緩沖液：20mM PB pH7.4

• 洗脫緩沖液：20mM PB+50mM~500mM NaCl 梯度洗脫，pH7.4

陰離子交換填料憑借其分辨率高、操作穩(wěn)定、易于放大等優(yōu)勢(shì)，已成為病毒載體純化中的關(guān)鍵單元操作，特別是在疫苗生產(chǎn)與基因治療載體制備中，發(fā)揮著不可替代的作用。隨著層析技術(shù)與填料設(shè)計(jì)的不斷迭代，AEX將持續(xù)在病毒載體工藝開(kāi)發(fā)中扮演關(guān)鍵角色。