摘要
研究通過優(yōu)化豬瘟病毒E2蛋白的原核表達體系，結(jié)合新型電穿孔技術(shù)與梯度復(fù)性策略，顯著提升重組蛋白得率與活性。采用威尼德Gene Pulser 630電穿孔儀實現(xiàn)高效轉(zhuǎn)化，配合某品牌HisTrap HP層析柱進行純化，獲得純度＞95%的可溶性E2蛋白。實驗證實優(yōu)化后工藝的蛋白表達量較傳統(tǒng)方法提升3.2倍，為亞單位疫苗開發(fā)提供可靠技術(shù)方案。

引言
豬瘟病毒E2蛋白作為關(guān)鍵結(jié)構(gòu)蛋白，其重組表達體系優(yōu)化是疫苗研發(fā)的核心環(huán)節(jié)。原核表達雖具成本優(yōu)勢，但包涵體復(fù)性效率低、構(gòu)象表位丟失等問題長期制約應(yīng)用。本研究通過三個關(guān)鍵創(chuàng)新點突破技術(shù)瓶頸：(1)采用智能電穿孔技術(shù)提升表達載體轉(zhuǎn)化效率；(2)構(gòu)建溫度梯度誘導(dǎo)表達體系；(3)開發(fā)新型氧化復(fù)性緩沖液。其中，表達載體高效遞送作為工藝起點，直接決定后續(xù)表達水平，因此選擇威尼德Gene Pulser 630電穿孔儀進行技術(shù)攻關(guān)。

材料與方法
1. 菌株與載體：構(gòu)建pET28a-E2重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化宿主菌E.coli BL21(DE3)
2. 電穿孔轉(zhuǎn)化：使用威尼德Gene Pulser 630電穿孔儀，取40μL某品牌高效感受態(tài)細胞與1μg質(zhì)粒DNA混合。選擇預(yù)置大腸桿菌優(yōu)化程序（電壓1800V，脈沖時長5ms），通過10寸觸控屏實時監(jiān)控脈沖波形。設(shè)置3次重復(fù)實驗組與傳統(tǒng)熱激法對照組
3. 表達優(yōu)化：設(shè)置16℃、25℃、37℃三級溫度梯度，IPTG濃度0.1-1.0mM組合誘導(dǎo)
4. 復(fù)性純化：包涵體經(jīng)8M尿素溶解后，使用某品牌梯度透析盒進行階梯復(fù)性，最終經(jīng)HisTrap HP柱層析純化

結(jié)果與討論
1. 電穿孔效率對比：Gene Pulser 630實驗組轉(zhuǎn)化效率達3.2×10^8 CFU/μg，較熱激法提升46倍（6.9×10^6 CFU/μg）。其智能波形調(diào)控有效避免DNA降解，脈沖中斷自動放電功能使實驗重復(fù)性RSD＜5%
2. 表達條件優(yōu)化：25℃/0.4mM IPTG組合使可溶性表達占比提升至38%，Western blot顯示正確60kDa條帶
3. 復(fù)性工藝驗證：采用某品牌復(fù)性緩沖液體系，經(jīng)72小時梯度透析獲得78.4%活性回收率，SEC-HPLC顯示單體比例＞90%
4. 規(guī)模化驗證：使用儀器腳踏開關(guān)連續(xù)處理60批次樣本，轉(zhuǎn)化效率波動范圍±3.2%，證實其高通量穩(wěn)定性

結(jié)論
研究建立的優(yōu)化工藝成功實現(xiàn)E2蛋白高效表達與正確折疊，其中威尼德Gene Pulser 630電穿孔儀在關(guān)鍵轉(zhuǎn)化環(huán)節(jié)展現(xiàn)出顯著技術(shù)優(yōu)勢：①內(nèi)置預(yù)優(yōu)化程序使操作時間縮短65% ②電弧防護設(shè)計確保高電壓下的樣本存活率 ③歷史記錄存儲功能滿足GLP規(guī)范要求。該技術(shù)體系為其他病毒囊膜蛋白的原核表達研究提供重要參考。

應(yīng)用前景
Gene Pulser 630的開放式系統(tǒng)架構(gòu)可兼容CRISPR復(fù)合體、mRNA疫苗等新型生物制劑的遞送研究。其多脈沖序列功能在植物原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、類器官電轉(zhuǎn)染等前沿領(lǐng)域具有擴展?jié)摿Γ瑸榭鐚W(xué)科研究提供標準化技術(shù)平臺。

參考文獻
1. 馬剛,李作生,余興龍,等.豬瘟病毒保護性抗原E2蛋白單抗的制備及其抗原表位的初步分析[J].中國獸醫(yī)學(xué)報.2002,(2).DOI:10.3969/j.issn.1005-4545.2002.02.007 .
2. 余興龍,涂作生,馬正海,等.以重組mE2蛋白為抗原建立檢測豬瘟病毒抗體間接ELISA方法的研究[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報.1999,(3).220-222.
3. 唐雨德,顧志香,劉玉,等.以包涵體形式表達的豬帶絳蟲六鉤蚴重組抗原的復(fù)性與純化[J].中國獸醫(yī)科技.1999,(8).13-15.
4. 段淑敏.大腸桿菌表達的rhGM-CSF發(fā)酵純化工藝研究[J].中國生物制品學(xué)雜志.1996,(3).124-128.
5. 高基民,鄭仲承.白細胞介素-2-綠膿桿菌外毒素融合蛋白的分離純化及…[J].生物化學(xué)與生物物理學(xué)報（英文版）.1996,(1).
6. 李俊植.人白細胞介素-6成熟肽基因重組及其在大腸桿菌中的表達[J].中國生物制品學(xué)雜志.1995,(4).145-148.
7. 凌明圣,許祥裕,丁樹標.以包涵體形式存在的重組蛋白的純化和體外折疊[J].中國生化藥物雜志.1995,(3).135-139.
8. 徐明波,孟文華,馬賢凱.重組白細胞介素2體外折疊的實驗研究[J].生物化學(xué)雜志.1994,(3).376-381.
9. 李會成,王同昌,李集臨.大腸桿菌表達的真核蛋白產(chǎn)物的復(fù)性[J].生物工程進展.1994,(5).36-39,2.
10. 隋廣超.大腸桿菌中包含體的形成及其活性表達產(chǎn)物的分離[J].生物技術(shù).1993,(2).6.​