PEAKS QC功能和蛋白變化趨勢設計結合實現最準確的TMT定量詳解
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本論文的數據分析工作由Bioinformatics Solutions Inc.PEAKS Studio團隊協助完成，成果已發表于J. Am. Soc. Mass Spectrom[1]。
取4份野生型小鼠腦組織蛋白酶切肽段，按照0.81:1:1:0.81比例分別標記TMT10plex的127N、128N、129N和130N，所產生的質譜數據使用PEAKS Studio完成分析，PSM和Protein group的FDR均設置為1%，共得到75997 PSMs，46313 peptides，6776 protein groups，7477 proteins。同時，用PEAKS獨有的Quality Control功能可以計算每一個PSM的CV值，結果如圖1和表1，表明在蛋白質組學數據中，樣本量越低，越容易產生更高的CVs。
圖1 兩組QC-plex的CV值分布
表1 不同QC設置的定量蛋白統計
在PEAKS軟件的TMT方法設置界面，可以添加Quality Control Replicate Channels，默認CV范圍為≤30%（圖2）。圖3A-D中，紫色區域表示定量的假陽性結果，對比四種QC的設置方式可以看出，QC-plex越多，假陽性的定量就越少。
圖2 PEAKS設置TMT Quality Control
圖3 QC-plex對定量假陽性的過濾
定量準確性與CV、unique peptides數量的關系
在表2中，進一步從unique peptide數量和CV方面比較了蛋白的定量準確性。當不使用QC-plex時，定量假陽性（Q<0.57 or >1.05）的蛋白有89個，分別設置QC-0.81、QC-1和QC-0.81&1后，定量假陽性的蛋白分別減少為77、24和15，并且也能看出unique peptide數量越少，越容易產生更高的CV，在應用了QC-plex后，即使unique peptide為1的蛋白，CV值也都在30%以下。
表2 不同QC設置的蛋白數統計
蛋白趨勢變化實驗設計
雖然上述實驗驗證了PEAKS QC功能對豐度較低且unique peptide數量少的蛋白定量的校正效果，但實際上，我們很難改變復雜生物學樣本中提取出來的蛋白豐度，因此本研究又設計了圖4所示的趨勢變化實驗（Trend design）的方案，從另一個角度實現TMT定量準確性的判斷。該方案共包含5組小鼠：野生型小鼠組（WT）、無處理基因敲除小鼠組（non-Treated）、低劑量低親和力分子處理基因敲除小鼠組（LowAffinity_LowDose）、低劑量高親和力分子處理基因敲除小鼠組（HighAffinity_LowDose）、高劑量高親和力分子處理基因敲除小鼠組（HighAffinity_HighDose），每組肽段使用不同channel的TMT試劑標記，然后等量混合進行質譜檢測。
圖4 不同分子親和力富集及劑量差異設計
圖5 不同處理組之間蛋白表達量的倍數變化
影響蛋白定量準確性的兩個主要因素，一個是豐度低，一個是unique peptide數量過少，但我們并不能改變未知樣品中存在的這兩個客觀問題，因此建議在實驗過程中盡可能多做一些重復，通過QC-plex來計算CV，從而檢驗重現性。此外，結合Trend-design，可以達到最準確的TMT定量效果（圖6）。
1. Xianyin Lai, Guihong Qi, Chris Kovach, Yaming Wang, Isaiah Clark, Keyue Chen, Zhixiang Yang, Nick Babb, Forest Andrews, Ross Fellows, Baozhen Shan, Weiwu Chen, Tom Yang, and Wenting Li. Journal of the American Society for Mass Spectrometry . DOI: 10.1021/jasms.3c00346.
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