背景知識：

細胞外囊泡（extracellular vesicles, EV）是由細胞釋放到胞外，由脂質(zhì)雙分子層包裹的微小囊泡。近年來，研究者對血液樣本中EV分析越來越感興趣，主要源于細胞分泌的EV攜帶多種物質(zhì)如核酸，蛋白質(zhì)，脂質(zhì)等，可以作為生物標志物，表征細胞發(fā)生的病理生理過程。由于血液成分的復雜性阻礙了EV的準確檢測，從而減緩了其在臨床應(yīng)用中的發(fā)展。目前已有多個研究證明，不同EV回收方法得到的不同回收效率和純度的EV，會影響血液樣本中基于EV的生物標志物分析。雖然研究人員已在嘗試理清整個EV檢測流程中，包括血液采集管（BCT）的類型以及血液處理間隔（BPI）（即血液采集和處理之間的時間）等因素，但真實影響情況仍未明確。另外，沒有適當且可量化的指標可用于幫助選擇最適合研究目標的BCT和BPI。因此，建立和驗證BCT和BPI的標準操作程序（SOP）仍然是迫切需要解決的問題，這也是建立可靠臨床相關(guān)的生物庫的先決條件，以及EV相關(guān)生物標志物發(fā)現(xiàn)和驗證的前提條件。

 

2023年3月，比利時根特大學Bert Dhondt等在《Journal Of Extracellular Vesicles》雜志上發(fā)表了題為：Benchmarking blood collection tubes and processing intervals for extracellular vesicle performance metrics的研究論文。作者詳細評估了11種BCT對9項性能指標的影響，包括血樣質(zhì)量、EV穩(wěn)定性、EV血細胞來源和EV相關(guān)蛋白質(zhì)組和小RNA轉(zhuǎn)錄組特征等，并對三個臨床相關(guān)樣本的BPI進行了額外評估（如圖1）。

實驗方法：

從健康人和癌癥患者處獲取血液樣本，經(jīng)血液指標分析與溶血分析后，合格血液樣本進入后續(xù)實驗。使用已有的分離方案，結(jié)合體積排除色譜（size-exclusion chromatography, SEC）和Optiprep密度梯度超速離心（ODG），從血清和血小板貧化血漿（Platelet depleted plasma, PDP）樣品中分離EV。繼而對分離獲得的EV進行物理表征，涉及尺寸和形態(tài)，同時液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法和二代測序等對EV進行蛋白組和轉(zhuǎn)錄組信息表征。其中 small RNA的文庫制備，由sage science公司的 Pippin系列全自動核酸電泳片段回收儀結(jié)合3% agarose預(yù)制膠，精準回收125-153 bp范圍的small RNA，去除雜帶，使得測序結(jié)果聚焦目標small RNA，清晰展現(xiàn)EV的small RNA圖譜。

 

在本文中，作者進行了第一次大規(guī)模EV血液標準（EV Blood Benchmarking , EVBB）研究，全面比較了BCT（n=11）和BPI（n=3）對EV分析的影響，目的是建立改進的血液EV分析程序，開發(fā)并實施了反映樣本質(zhì)量、EV回收率、血細胞衍生的EV亞型的離體釋放以及EV相關(guān)分子特征的性能指標。基于這些發(fā)現(xiàn)，本文為研究人員提供了一般性建議，指導根據(jù)情況選擇相應(yīng)的BCT和BPI（圖2）。EVBB研究有助于血液EV研究的方法標準化，該研究提供了性能指標，可作為新開發(fā)的BCT、額外BPI以及其他因素分析的框架，并支持EV研究方法的進一步標準化。

引用文獻：

Dhondt, Bert, et al. "Benchmarking blood collection tubes and processing intervals for extracellular vesicle performance metrics." Journal of Extracellular Vesicles 12.5 (2023): e12315.

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