導讀

在新型冠狀病毒感染咳嗽的診斷與治療專家共識（2023，46）中針對咳黃膿痰或外周血白細胞增高提示可能存在細菌感染，在2021年發(fā)表的95例COVID-19患者合并細菌及真菌感染的臨床分析中，結果表明，COVID-19危重型患者易合并鮑曼不動桿菌和肺炎克雷伯菌等細菌和真菌的感染，肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)屬于腸桿菌科克雷伯菌屬，是一類重要的醫(yī)源性感染革蘭氏陰性條件致病菌，對多數(shù)抗菌藥物易產生耐藥性，占臨床分離菌的13%，成為僅次于大腸埃希菌 (19%)的院內感染第二大致病菌。

上海交通大學生命科學技術學院微生物代謝國重實驗室科學家基于naica^®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)建立了肺炎克雷伯菌的數(shù)字PCR檢測方法。數(shù)字PCR檢測靈敏度最低檢出限可達到3.37copies/μL；方法的相對標準偏差(relative standard deviation，RSD)均小于25%；本研究利用優(yōu)化后的數(shù)字PCR方法共檢測了28 株臨床菌株，檢測到14株為肺炎克雷伯菌，14株為其他種屬，該方法特異性好、靈敏度高、準確度高，適合肺炎克雷伯菌的核酸檢測和定量分析，也為其他臨床病原菌的分子檢測提供了新的技術參考。

應用亮點：

▶  數(shù)字PCR (digital PCR，dPCR)作為第3代 PCR技術，具有簡便快速、靈敏度高、精確度高的特點，可檢出微量的細菌核酸分子。

▶ 與傳統(tǒng)的qPCR 相比，dPCR不受擴增效率的影響，無需依賴擴增曲線、無需標準曲線即可進行絕對定量，同時對低濃度的核酸定量更加準確可靠。

實驗結果：

１、通過數(shù)字PCR的檢測范圍和靈敏性實驗得到，cdPCR樣品后續(xù)可在S5−S9樣本檢測范圍內進行。

▲圖１.數(shù)字PCR對不同稀釋度標準品靈敏度測試結果。
藍色：陽性微滴；灰色：陰性微滴；NTC：陰性對照

２、數(shù)字PCR與熒光定量PCR的檢出范圍和靈敏性實驗，得到cdPCR對低濃度樣品的檢測更準確。此外，cdPCR的最低檢出限(3.37copies/μL)，較qPCR (194.9 copies/μL) 有更高的檢測靈敏度。

▲圖2: pUC57-16S的數(shù)字PCR (A)和熒光定量PCR (B)的標準曲線圖 2B不同稀釋倍數(shù)標準品檢測的Ct值：S1：9.84；S2：12.89；S3：16.21；S4：19.74；S5：22.34；S6：25.69；S7：28.11；S8：32.56；S9：35.42

３、同時對3株肺炎克雷伯菌和4株其他菌株進行特異性評估驗證，cdPCR方法對肺炎克雷伯菌的特異性檢測有效。

4、利用cdPCR對28株臨床菌株進行檢測，有14株菌為肺炎克雷伯菌，14株為其他菌株，說明cdPCR具有臨床菌株檢測應用潛力。

綜上所述，本研究建立了檢測肺炎克雷伯菌的數(shù)字PCR方法。與qPCR技術相比，cdPCR可以精準地對核酸進行絕對定量分析，檢測下限低至單拷貝，不依賴于標準曲線， 具有較好的數(shù)據(jù)重現(xiàn)性，在稀有樣品或痕量樣品的檢測方面具有獨特的優(yōu)勢。因此，該方法為提高肺炎克雷伯菌的早期核酸檢測提供了新方法，也為核酸絕對定量提供了新的數(shù)據(jù)支持。

同時naica^®六通道數(shù)字PCR系統(tǒng)為新冠病毒合并細菌感染的多重檢測提供可能。

naica^®六通道數(shù)字PCR系統(tǒng)

法國Stilla Technologies公司naica^®六通道數(shù)字PCR系統(tǒng)，源于Crystal微滴芯片式數(shù)字PCR技術，自動化微滴生成和擴增，每個樣本孔可實現(xiàn)6熒光通道的檢測，智能化識別微滴并進行質控，3小時內即可獲得至少6個靶標基因的絕對拷貝數(shù)濃度。