心血管疾病的機(jī)制研究一直是生物醫(yī)學(xué)研究的重點(diǎn)領(lǐng)域之一。近年來(lái)，隨著新技術(shù)的不斷涌現(xiàn)人們對(duì)心血管疾病發(fā)生與發(fā)展的機(jī)制認(rèn)識(shí)不斷深化并極大地改善了臨床診療水平。而對(duì)于單心肌細(xì)胞興奮收縮偶聯(lián)機(jī)制以及病理生理狀態(tài)下心肌收縮舒張功能障礙的研究為我們?cè)诩?xì)胞學(xué)層面理解心肌疾病提供了重要的基礎(chǔ)。近期，斯坦福大學(xué)的研究者在《European Heart Journal》雜志發(fā)表了題為Modelling diastolicdysfunction in induced pluripotent stemcell-derived cardiomyocytes fromhypertrophic cardiomyopathy patients的研究論文，采用了新的視角去探索心臟疾病中心肌細(xì)胞的功能與疾病之間的聯(lián)系。

       舒張功能障礙（Diastolic dysfunction，DD）是肥厚型心肌病（HCM）患者的顯著臨床特征也是導(dǎo)致肥厚型心肌病患者死亡的主要原因，表現(xiàn)為舒張期心室舒張緩慢或不完全。HCM患者發(fā)生心肌舒張功能障礙的具體細(xì)胞學(xué)機(jī)制尚不完全清楚，嚴(yán)重限制了臨床治療效果。

       在以往的研究中，人們建立了多種HCM的動(dòng)物模型(從嚙齒動(dòng)物到大型動(dòng)物)和疾病誘導(dǎo)方法。但是，由于種屬差異，動(dòng)物模型的研究結(jié)果距離臨床應(yīng)用相去較遠(yuǎn)，急需人源化的研究手段。近年來(lái)，采用肥厚型心肌病患者來(lái)源的多能干細(xì)胞源性心肌細(xì)胞（iPSC-CM）在研究舒張功能障礙在肥厚型心肌病中的潛在機(jī)制以及新藥研發(fā)方面具有巨大潛力。

       在該研究中，采用了Plexithermo HCell系列單心肌細(xì)胞功能檢測(cè)系統(tǒng)。首先通過外周血單核細(xì)胞重編程和誘導(dǎo)分化成功建立了舒張功能障礙的iPSC-CM細(xì)胞模型，該模型攜帶了家族性HCM中最常見的三種基因突變（即：肌球蛋白重鏈7， MYH7、肌球蛋白結(jié)合蛋白C3，MYBPC3和心肌肌鈣蛋白T2 ，TNNT2)。經(jīng)過細(xì)胞鑒定后進(jìn)行舒張功能分析。與正常對(duì)照組iPSC-CM細(xì)胞相比，HCM iPSC-CM 組心肌細(xì)胞舒張期肌節(jié)長(zhǎng)度明顯縮短；出現(xiàn)最大舒張速率降低和舒張時(shí)間延長(zhǎng)而收縮速率未見變化。

圖1：肥厚型心肌病患者來(lái)源的多功能干細(xì)胞衍生分化心肌細(xì)胞出現(xiàn)舒張功能障礙。（A）iPSC-CMs的免疫熒光染色微陣列圖像，顯示排列的肌節(jié)結(jié)構(gòu)。（B和C）采用過表達(dá)GFP-actin熒光顯示iPSC-CMs肌節(jié)，并通過活細(xì)胞共聚焦掃描獲得肌節(jié)收縮舒張圖像。（D-G）與正常對(duì)照iPSC-CMs組相比，HCM-iPSC-CM組出現(xiàn)舒張期肌節(jié)長(zhǎng)度縮短（D）、最大肌節(jié)舒張長(zhǎng)度（E）不變、最大舒張速率（F）減慢、90%舒張時(shí)間（G）延長(zhǎng)。

       細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)在心肌細(xì)胞興奮收縮偶聯(lián)中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，該研究進(jìn)一步通過Fura-2 AM熒光成像方法發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組iPSC-CM相比，HCM-iPSC-CM在舒張期心肌細(xì)胞內(nèi)[Ca2+] i水平顯著升高和出現(xiàn)Ca2+失穩(wěn)態(tài)，且在β-腎上腺素刺激下Ca2+失衡進(jìn)一步加劇。同步觀察心肌細(xì)胞內(nèi)鈣瞬變和心肌收縮力結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HCM-iPSC-CM的肌絲具有更強(qiáng)Ca2+敏感性（以dF/Δ[Ca2+]i衡量）。并且，通過CRISPR / Cas9對(duì)正常心肌細(xì)胞構(gòu)建TNNT2 R92W突變或者對(duì)HCM-iPSC-CM的突變進(jìn)行修正，均證實(shí)了肥厚性心肌病的基因突變可導(dǎo)致心肌出現(xiàn)舒張期鈣超載，鈣回?cái)z減慢，肌絲鈣敏感性增強(qiáng)，最終損害HCM-iPSC-CM的舒張功能。

圖2：Fura-2AM熒光指示檢測(cè)HCM-iPSC-CMs舒張期細(xì)胞內(nèi)Ca2+。與Ctrl-iPSC-CMs相比， HCM-iPSC-CMs舒張期細(xì)胞內(nèi)Ca2+升高（B），Ca2+回?cái)z顯著延長(zhǎng)（C）。采用咖啡因誘發(fā)鈣瞬變發(fā)現(xiàn)HCM-iPSC-CMs的SR釋放更多的Ca2+，鈣瞬變衰減時(shí)間延長(zhǎng)。

圖3：細(xì)胞功能成像顯示HCM-iPSC-CMs舒張功能障礙。同時(shí)記錄心肌細(xì)胞鈣瞬變和細(xì)胞收縮應(yīng)力，與Ctrl-iPSC-CMs相比，HCM-iPSC-CMs的鈣瞬變幅值未發(fā)生顯著變化，但是鈣瞬變速率和肌絲鈣敏感性均增強(qiáng)。

圖4：β-腎上腺素處理加重HCM-iPSC-CMs舒張功能障礙。ISO處理進(jìn)一步提高了HCM-iPSC-CMs中舒張期細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，顯著延長(zhǎng)了鈣瞬變衰減時(shí)間，加重細(xì)胞內(nèi)Ca2+異常失衡。雖然ISO處理對(duì)Ctrl-iPSC-CMs和HCM-iPSC-CMs的收縮節(jié)律均有提高，但HCM-iPSC-CMs組中出現(xiàn)更為嚴(yán)重的舒張期肌節(jié)長(zhǎng)度縮短；舒張速率降低和舒張時(shí)間延長(zhǎng)。
 

       上述結(jié)果表明了Ca2+穩(wěn)態(tài)對(duì)HCM-iPSC-CM的舒張功能的重要作用，該研究進(jìn)而采用Ca2+阻斷劑（10–200 nM verapamil 和 10–500 nM diltiazem)和晚期Na+通道阻斷劑（1–10 µM ranolazine 和 200nM to 1 µM eleclazine)處理可顯著改善HCM-iPSC-CM的心肌舒張功能，表現(xiàn)為縮短舒張期肌節(jié)長(zhǎng)度，加快舒張速率，減少舒張時(shí)間；并顯著促進(jìn)了HCM-iPSC-CM的存活。并且發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組iPSC-CM相比，HCM iPSC-CM中L型Ca2+通道（LTCC）和瞬時(shí)受體電位陽(yáng)離子通道（TRPC1，3）的表達(dá)顯著增加，導(dǎo)致TRPC依賴的Ca2+內(nèi)流增強(qiáng)。這可能是導(dǎo)致HCM-iPSC-CM舒張期鈣超載的重要原因。

圖5：Ca2+阻斷劑和晚期Na+通道阻斷劑可改善HCM-iPSC-CMs鈣穩(wěn)態(tài)和舒張功能。Ca2+阻斷劑和晚期Na+通道阻斷劑處理可降低HCM-iPSC-CMs舒張期細(xì)胞內(nèi)Ca2+并縮短鈣瞬變；增加舒張期肌節(jié)長(zhǎng)度和舒張速率，縮短舒張時(shí)間。

圖6：恢復(fù)鈣穩(wěn)態(tài)可顯著提高長(zhǎng)時(shí)程β-腎上腺素刺激下的HCM-iPSC-CMs存活率。對(duì)HCM-iPSC-CMs中鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)控的關(guān)鍵因子的表達(dá)水平進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)Cav1.2,MYH7, NPPA和NPPB表達(dá)增加，MYH6,Casq2和Cav3表達(dá)降低。CaMKIId自磷酸化（pThr286）較Ctrl-iPSC-CMs明顯增強(qiáng)。通過Ca2+阻斷劑和晚期Na+通道阻斷劑處理可緩解上述異常，并且有效緩解長(zhǎng)時(shí)程β-腎上腺素刺激導(dǎo)致的HCM-iPSC-CMs鈣超載和細(xì)胞死亡，有效提高HCM-iPSC-CMs的存活率。

圖7：采用患者來(lái)源的iPSC-CM模型揭示肥厚型心肌病舒張功能障礙的細(xì)胞機(jī)制示意圖。

       該研究建立了一個(gè)新穎的平臺(tái)來(lái)研究基于HCM患者的iPSC-CM的舒張功能障礙的相關(guān)細(xì)胞學(xué)機(jī)制：首次在單細(xì)胞水平上證明了舒張期Ca2+超載和肌絲Ca2+敏感性增加均與HCM iPSC-CM的舒張功能障礙密切相關(guān)。此外，該研究還表明通過常用藥物治療（例如Ca2+通道阻斷劑和Na+通道阻滯劑）可以改善HCM-iPSC-CMs的舒張功能。該研究表明，基于HCM患者的 iPSC-CM 模型的功能成像分析和藥物檢測(cè)為心肌細(xì)胞病理生理學(xué)機(jī)制研究和發(fā)展?jié)撛诘腍CM治療策略提供了新的研究平臺(tái)。
 

參考文獻(xiàn):

Haodi, W. , Huaxiao, Y. , June-Wha, R. , Zhang, J. Z. , Keung, L. C. , & Karim, S. , et al. (0). Modelling diastolic dysfunction in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes from hypertrophic cardiomyopathy patients. European Heart Journal(45), 45.