肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是原發(fā)性肝癌的主要類型，約占肝癌患者85%-90%。對(duì)于早期肝癌，手術(shù)切除和肝移植仍是最為有效的治療手段。然而，由于肝癌早期診治困難，病情進(jìn)展快、預(yù)后較差，大部分患者確診時(shí)已失去了手術(shù)時(shí)機(jī)。
 
Case Study
 
最近，上海交通大學(xué)覃文新研究員，荷蘭癌癥研究所Leila Akkari及René Bernards共同通訊在Nature 發(fā)表題為"Inducing and exploiting vulnerabilities for the treatment of liver cancer"的研究論文。該研究通過CRISPR-Cas9基因敲除技術(shù)結(jié)合高通量化合物篩選，提出先利用腫瘤細(xì)胞突變特異誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生衰老、進(jìn)而清除衰老腫瘤細(xì)胞而對(duì)正常生長(zhǎng)細(xì)胞無影響的“One-two punch（組合拳式或分步式）”肝癌精準(zhǔn)治療新策略。
 

 
細(xì)胞分裂是組織發(fā)育和維持的一種正常功能。細(xì)胞分裂異常，尤其是細(xì)胞分裂不受控制，是癌細(xì)胞的一個(gè)標(biāo)志性特征。科學(xué)家通常非常關(guān)注細(xì)胞增殖的速度。文中采用Incucyte®實(shí)時(shí)活細(xì)胞成像系統(tǒng)監(jiān)控癌細(xì)胞的健康和活力，同時(shí)觀察藥物處理后，不同細(xì)胞系克隆的形成狀態(tài)。傳統(tǒng)的增殖研究方法多為終點(diǎn)法，科學(xué)家可能還需要獲得準(zhǔn)確的細(xì)胞計(jì)數(shù)， Incucyte®不僅可以通過測(cè)定匯合度來估計(jì)細(xì)胞數(shù)量，同時(shí)還可以利用Nuclight 快速紅色試劑獲得準(zhǔn)確的細(xì)胞計(jì)數(shù)。
   
利用CRISPR–Cas9基因篩查和慢病毒導(dǎo)向RNA（gRNA）文庫(kù)，該文庫(kù)包括Hep3B和Huh7肝癌細(xì)胞中的所有人類激酶（圖1a）。成功篩選出在肝癌細(xì)胞中選擇性誘導(dǎo)衰老的多種化合物，XL413是DNA復(fù)制激酶CDC7的有效抑制劑，在誘導(dǎo)Hep3B和Huh7細(xì)胞中衰老相關(guān)的β-半乳糖苷酶（SA-β-gal，衰老標(biāo)記物）方面是這些化合物中最具選擇性的（圖1b，1c，1d）。這些發(fā)現(xiàn)表明， CDC7為肝癌衰老誘導(dǎo)策略的靶標(biāo)。
     
利用濃度增加的XL413處理了一組未轉(zhuǎn)化細(xì)胞和肝癌細(xì)胞系。TP53突變的肝癌細(xì)胞系的增殖受損，而野生型TP53（SK-Hep1和Huh6細(xì)胞）的肝癌細(xì)胞系以及所有四種未轉(zhuǎn)化細(xì)胞系對(duì)XL413均不敏感，利用Incucyte® 實(shí)時(shí)活細(xì)胞成像系統(tǒng)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)不同細(xì)胞系的克隆形成（圖2），更容易發(fā)現(xiàn)TP53突變狀態(tài)與對(duì)CDC7的抑制作用之間的因果關(guān)系。XL413的抗增殖作用與TP53突變的肝癌細(xì)胞中衰老標(biāo)記物的誘導(dǎo)有關(guān)，但與野生型TP53的肝癌細(xì)胞或非轉(zhuǎn)化細(xì)胞中的衰老標(biāo)記物無關(guān)，并且在TP53突變的肝癌細(xì)胞中，XL413使衰老標(biāo)記物14富集。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，CDC7的敲除會(huì)損害TP53突變的肝癌細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)衰老，但對(duì)野生型TP53的細(xì)胞沒有影響。
   
 
為了探索mTOR抑制劑是否可以在XL413誘導(dǎo)衰老模型中用作有效藥物，作者分析了mTOR抑制劑（AZD8055）的活性。用XL413處理兩種肝癌細(xì)胞系10天后，再用濃度增加的mTOR抑制劑處理5~7天，通過Incucyte® 實(shí)時(shí)活細(xì)胞成像系統(tǒng)進(jìn)行克隆形成實(shí)驗(yàn)的監(jiān)測(cè)，發(fā)現(xiàn)XL413處理的細(xì)胞系加入mTOR抑制劑后，克隆形成率明顯降低（圖3a）。與此同時(shí)，在加入mTOR抑制劑96h后，利用Caspase-3/7處理細(xì)胞，進(jìn)行凋亡實(shí)驗(yàn)，通過Incucyte® 實(shí)時(shí)活細(xì)胞成像系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞熒光強(qiáng)度的變化，更好地詮釋了mTOR抑制劑可顯著增加XL413處理的肝癌細(xì)胞系的凋亡（圖3b）。
 

圖3 a. Huh7和Hep3B肝癌細(xì)胞系加入濃度增加的XL413和AZD8055后的克隆形成；b. Huh7和Hep3B肝癌細(xì)胞系加入濃度增加的XL413和AZD8055后的細(xì)胞凋亡
 
為了評(píng)估體外發(fā)現(xiàn)是否可以在體內(nèi)重現(xiàn)，研究者制作了Huh7和MHCC97H異種移植物。與載體、AZD8055或XL413和AZD8055組合治療的腫瘤相比，XL413治療的腫瘤顯示DNA損傷和SA-β-gal+衰老細(xì)胞增加對(duì)XL413和AZD8005的抑制作用表明CDC7在體內(nèi)誘導(dǎo)衰老。與索拉非尼治療相比，XL413和AZD8055聯(lián)合治療可更有效地抑制生長(zhǎng)，而TP53突變的聯(lián)合治療異種移植物顯示4EBP1的增殖和磷酸化減少，與凋亡增加相關(guān)。

在這種侵襲性肝癌模型中，接受XL413或AZD8055單藥治療的TP53q敲除腫瘤顯示出腫瘤體積的適度減少和小鼠壽命的延長(zhǎng)，而XL413與AZD8055聯(lián)合治療的耐受性良好，與對(duì)照組相比，顯著降低了腫瘤負(fù)擔(dān)并提高了生存率。重要的是，在聯(lián)合治療組中，SA-β-gal陽(yáng)性和p16（INK4A）陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量減少，這表明通過AZD8055治療可以有效地消除衰老細(xì)胞。
 
 
Summary

本研究證實(shí)，使用CDC7抑制劑的促衰老療法，結(jié)合mTOR抑制劑，可以減輕衰老細(xì)胞的細(xì)胞自主性和非細(xì)胞自主性，從而降低腫瘤復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)，從而為肝癌患者帶來臨床益處。利用誘發(fā)的脆弱性可能是治療肝癌的有效方法。
 
 
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-參考文獻(xiàn)-
【1】Wenxin Qin, Leila Akkari & René Bernards. Inducing and exploiting vulnerabilities for the
treatment of liver cancer. Nature. https://doi.org/10.1038/s41586-019-1607-3