罕見病囊性纖維化致病基因：CFTR基因及其小鼠模型
六英尺，雖然不遠，但也是讓人無法觸手可及的距離。電影《五尺天涯》中，就講述了一個因雙方患有囊腫性纖維化疾病，而不得不在六尺距離規則下進行的愛情故事。在這呢，就不得不提到一個與之密切聯系的基因——CFTR基因。CFTR基因可以激活氯離子通路，也可以調控其他離子通路，因而可以對細胞的整體鹽和水分起到調控作用。該基因的異常表達，會導致囊性纖維化的發生，使患者在氣道、胰腺、小腸等通道中產生粘稠液體。該病是一種進行性疾病，更是一種罕見病。
賽業生物《每周一鼠》，每周為大家講解一個小鼠模型的故事，希望對大家了解不同的小鼠模型有所幫助。今天和大家見面的是CFTR基因編輯小鼠。
⭐ CFTR基因介紹
CFTR基因是由12跨膜區域、兩個核苷酸結合區域（NBD1/2）和一個調節R區域組成，該基因與囊性纖維化具有緊密的聯系。其激活需要cAMP介導，而NBD區域會與ATP結合。但也有研究指出，CFTR可以通過不依賴cAMP的途徑激活。
CFTR在調控離子通路的過程中發揮重要的作用。其基因主要介導了細胞內氯離子跨膜向細胞外運動，同時伴隨水分子的轉運。除了本身能介導氯離子的外流之外，CFTR還能通過ROMK2介導鉀離子向細胞外的運輸，ROMK2能與細胞內的NBD1和調控R結構域相互作用。此外，CFTR還能通過結合ATP到PY2R蛋白上調控ORCC介導的氯離子外流通道，并且能抑制ENaC蛋白活性進而調控鈉離子的內流。
⭐ CFTR相關疾病介紹
囊性纖維化（cystic fibrosis，CF）是一種遺傳性疾病，會對肺部、消化系統和身體其他器官造成嚴重損害。由于囊性纖維化跨膜轉導調節蛋白位于多種腺體的上皮細胞的頂部質膜中，因而該病會影響不同種類的分泌細胞產生的細胞液，使患者細胞分泌的粘液變得粘稠；無法對細胞表面進行潤滑，還會導致管路堵塞，尤其是在肺部和胰腺。
⭐ CFTR基因敲除小鼠
人與小鼠在氨基酸序列的同源性是78%，研究人員通過在該基因10號外顯子中插入終止密碼子（S489X），制備了第一種CFTR敲除小鼠（CFTRtm1UNC）。另外，研究人員還通過其他方法得到CFTR全基因敲除小鼠，如CFTRtm1CAM、CFTRtm1HSC、CFTRtm1BAY和CFTRtm3BAY，這些小鼠品系都檢測不到野生型CFTR的mRNA。除了敲除模型，不同的實驗室也構建許多點突變的模型。一些會導致CF的突變也引入小鼠CFTR中產生Class II突變的△F508小鼠模型（CFTRtm1EUR、CFTRtm1KTH和CFTRtm2CAM）、G480C突變的模型（CFTRtm2HGU）和Class III突變的G551D小鼠模型（CFTRtm1G551D）。
有研究指出，使用小鼠模型研究囊性纖維化具有較容易構建、繁育周期短以及飼養成本低優點。然而，使用小鼠模型研究囊性纖維化也有一些限制，比如小鼠模型無法在未攻毒的情況下產生自發性肺部感染。并且大部分小鼠模型的實驗結果顯示在小鼠胰腺、肝臟和輸精管只有輕微并發癥，這與人的表型嚴重程度具有很大差異。造成這種結果的原因可能是因為低表達量的CFTR可能產生足夠的離子轉運能力使得小鼠模型的嚴重程度比較低，此外，小鼠中存在另外的上皮表達的氯離子通道可以代償CFTR的離子通道功能。
Gawenis等人通過BAC轉基因的方式制備了表達人源CFTR的小鼠，轉入了人源CFTR基因（約6拷貝）的鼠源CFTR，敲除小鼠的相關表型得到了挽救。
⭐ 總結
CFTR基因可以激活氯離子通路，也可以調控其他離子通路，因而可以對細胞的整體鹽和水分起到調控作用。該基因異常會導致囊性纖維化，在氣道、胰腺、小腸等通道中產生粘稠液體。通過研發構建這種罕見病的相關模型，對于其治療藥物的開發具有重要意義。
⭐ 參考文獻：
1. https://rddc.tsinghua-gd.org/details/gene?gene=Jmallx
2. Lavelle GM, White MM, Browne N, McElvaney NG, Reeves EP. Animal Models of Cystic Fibrosis Pathology: Phenotypic Parallels and Divergences. Biomed Res Int. 2016;2016:5258727. doi: 10.1155/2016/5258727. Epub 2016 Jun 1.
3. Rosen BH, Chanson M, Gawenis LR, Liu J, Sofoluwe A, Zoso A, Engelhardt JF. Animal and model systems for studying cystic fibrosis. J Cyst Fibros. 2018 Mar;17(2S):S28-S34. doi: 10.1016/j.jcf.2017.09.001. Epub 2017 Sep 19.
4. Gawenis LR, Hodges CA, McHugh DR, Valerio DM, Miron A, Cotton CU, Liu J, Walker NM, Strubberg AM, Gillen AE, Mutolo MJ, Kotzamanis G, Bosch J, Harris A, Drumm ML, Clarke LL. A BAC Transgene Expressing Human CFTR under Control of Its Regulatory Elements Rescues Cftr Knockout Mice. Sci Rep. 2019 Aug 14;9(1):11828. doi: 10.1038/s41598-019-48105-4.
5. Fabbri E, Tamanini A, Jakova T, Gasparello J, Manicardi A, Corradini R, Sabbioni G, Finotti A, Borgatti M, Lampronti I, Munari S, Dechecchi MC, Cabrini G, Gambari R. A Peptide Nucleic Acid against MicroRNA miR-145-5p Enhances the Expression of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) in Calu-3 Cells. Molecules. 2017 Dec 29;23(1):71. doi: 10.3390/molecules23010071.
賽業生物《每周一鼠》，每周為大家講解一個小鼠模型的故事，希望對大家了解不同的小鼠模型有所幫助。今天和大家見面的是CFTR基因編輯小鼠。
⭐ CFTR基因介紹
CFTR基因是由12跨膜區域、兩個核苷酸結合區域（NBD1/2）和一個調節R區域組成，該基因與囊性纖維化具有緊密的聯系。其激活需要cAMP介導，而NBD區域會與ATP結合。但也有研究指出，CFTR可以通過不依賴cAMP的途徑激活。
CFTR在調控離子通路的過程中發揮重要的作用。其基因主要介導了細胞內氯離子跨膜向細胞外運動，同時伴隨水分子的轉運。除了本身能介導氯離子的外流之外，CFTR還能通過ROMK2介導鉀離子向細胞外的運輸，ROMK2能與細胞內的NBD1和調控R結構域相互作用。此外，CFTR還能通過結合ATP到PY2R蛋白上調控ORCC介導的氯離子外流通道，并且能抑制ENaC蛋白活性進而調控鈉離子的內流。
圖1. CFTR基因相關信息
來源：（https://rddc.tsinghua-gd.org/）
來源：（https://rddc.tsinghua-gd.org/）
⭐ CFTR相關疾病介紹
囊性纖維化（cystic fibrosis，CF）是一種遺傳性疾病，會對肺部、消化系統和身體其他器官造成嚴重損害。由于囊性纖維化跨膜轉導調節蛋白位于多種腺體的上皮細胞的頂部質膜中，因而該病會影響不同種類的分泌細胞產生的細胞液，使患者細胞分泌的粘液變得粘稠；無法對細胞表面進行潤滑，還會導致管路堵塞，尤其是在肺部和胰腺。
圖2. CFTR介導的離子通道調控模式[2]
⭐ CFTR基因敲除小鼠
人與小鼠在氨基酸序列的同源性是78%，研究人員通過在該基因10號外顯子中插入終止密碼子（S489X），制備了第一種CFTR敲除小鼠（CFTRtm1UNC）。另外，研究人員還通過其他方法得到CFTR全基因敲除小鼠，如CFTRtm1CAM、CFTRtm1HSC、CFTRtm1BAY和CFTRtm3BAY，這些小鼠品系都檢測不到野生型CFTR的mRNA。除了敲除模型，不同的實驗室也構建許多點突變的模型。一些會導致CF的突變也引入小鼠CFTR中產生Class II突變的△F508小鼠模型（CFTRtm1EUR、CFTRtm1KTH和CFTRtm2CAM）、G480C突變的模型（CFTRtm2HGU）和Class III突變的G551D小鼠模型（CFTRtm1G551D）。
圖3. CFTR基因突變小鼠模型[2]
有研究指出，使用小鼠模型研究囊性纖維化具有較容易構建、繁育周期短以及飼養成本低優點。然而，使用小鼠模型研究囊性纖維化也有一些限制，比如小鼠模型無法在未攻毒的情況下產生自發性肺部感染。并且大部分小鼠模型的實驗結果顯示在小鼠胰腺、肝臟和輸精管只有輕微并發癥，這與人的表型嚴重程度具有很大差異。造成這種結果的原因可能是因為低表達量的CFTR可能產生足夠的離子轉運能力使得小鼠模型的嚴重程度比較低，此外，小鼠中存在另外的上皮表達的氯離子通道可以代償CFTR的離子通道功能。
Gawenis等人通過BAC轉基因的方式制備了表達人源CFTR的小鼠，轉入了人源CFTR基因（約6拷貝）的鼠源CFTR，敲除小鼠的相關表型得到了挽救。
圖4. 人源化小鼠的構建方案[4]
⭐ 總結
CFTR基因可以激活氯離子通路，也可以調控其他離子通路，因而可以對細胞的整體鹽和水分起到調控作用。該基因異常會導致囊性纖維化，在氣道、胰腺、小腸等通道中產生粘稠液體。通過研發構建這種罕見病的相關模型，對于其治療藥物的開發具有重要意義。
⭐ 參考文獻：
1. https://rddc.tsinghua-gd.org/details/gene?gene=Jmallx
2. Lavelle GM, White MM, Browne N, McElvaney NG, Reeves EP. Animal Models of Cystic Fibrosis Pathology: Phenotypic Parallels and Divergences. Biomed Res Int. 2016;2016:5258727. doi: 10.1155/2016/5258727. Epub 2016 Jun 1.
3. Rosen BH, Chanson M, Gawenis LR, Liu J, Sofoluwe A, Zoso A, Engelhardt JF. Animal and model systems for studying cystic fibrosis. J Cyst Fibros. 2018 Mar;17(2S):S28-S34. doi: 10.1016/j.jcf.2017.09.001. Epub 2017 Sep 19.
4. Gawenis LR, Hodges CA, McHugh DR, Valerio DM, Miron A, Cotton CU, Liu J, Walker NM, Strubberg AM, Gillen AE, Mutolo MJ, Kotzamanis G, Bosch J, Harris A, Drumm ML, Clarke LL. A BAC Transgene Expressing Human CFTR under Control of Its Regulatory Elements Rescues Cftr Knockout Mice. Sci Rep. 2019 Aug 14;9(1):11828. doi: 10.1038/s41598-019-48105-4.
5. Fabbri E, Tamanini A, Jakova T, Gasparello J, Manicardi A, Corradini R, Sabbioni G, Finotti A, Borgatti M, Lampronti I, Munari S, Dechecchi MC, Cabrini G, Gambari R. A Peptide Nucleic Acid against MicroRNA miR-145-5p Enhances the Expression of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) in Calu-3 Cells. Molecules. 2017 Dec 29;23(1):71. doi: 10.3390/molecules23010071.
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