導語

在實驗過程中，最心累的莫過于好不容易提取的核酸卻降解了。那么核酸為什么會發(fā)生降解呢，我們又該如何預防呢？關于核酸降解，你了解多少呢？讓我們一起對核酸降解一探究竟吧。

   什么是核酸   

核酸是一種高分子化合物，核苷酸是構(gòu)成核酸的基本單位。核酸水解后得到許多核苷酸，核苷酸是組成核酸的基本單位，即組成核酸分子的單體。

一個核苷酸分子是由一分子含氮的堿基、一分子五碳糖和一分子磷酸組成的。根據(jù)五碳糖的不同可以將核苷酸分為脫氧核糖核苷酸和核糖核苷酸。如果5-碳糖是核糖，則形成的聚合物是RNA；如果5-碳糖是脫氧核糖，則形成的聚合物是DNA。

   核酸降解本質(zhì)   

核酸降解是DNA/RNA分子中的堿基和戊糖間的氮糖苷鍵，或磷酸二酯鍵在物理因素、化學因素和生物因素等作用下發(fā)生水解，使DNA/RNA鏈發(fā)生斷裂。

核苷磷酸化酶：能分解核苷生成含氨堿基和戊糖的磷酸酯酶。廣泛存在于生物體內(nèi),催化的反應可逆。可在核苷水解酶作用下繼續(xù)分解核苷成嘌呤堿、嘧啶堿和戊糖。

核苷水解酶：主要存在于植物和微生物體內(nèi)，只水解核糖核苷。

   核酸降解原因   

DNA降解的因素很多，主要分為物理因素，化學因素和生物因素。

一、物理因素：溫度，機械剪切力、核酸的反復凍融、高溫煮沸及輻射等。

二、化學因素：PH值，水解反應，氧化反應等。

三、生物因素：酶解及微生物侵染等作用。

一、物理因素的影響

★ 溫度：高溫條件下，RNA不穩(wěn)定，易加速磷酸二酯鍵的水解，使核酸降解；

★ 機械剪切力：包括劇烈震蕩、攪拌、細胞突然至于低滲溶液中，以及讓溶液快速通過狹長的孔道；

★ 核酸的反復凍融、高溫煮沸及輻射等，均會導致核酸的降解。

二、化學因素影響水解

★ PH值：氫離子參與催化磷酸二酯鍵、糖苷鍵的水解，但糖苷鍵比磷酸二酯鍵更易被酸水解。過高或過低的PH值都易破壞復鍵。核酸(特別是RNA)在堿性溶液中十分容易降解；

★ 氧化反應：會氧化堿基中的含氨雜環(huán)，使其變性，從而改變一級與二級的核酸構(gòu)象；

★ 苯酚在空氣中被氧化生成醌，它能夠產(chǎn)生自由基，直接用于DNA的分離，會使磷酸酯鍵斷裂，造成DNA的降解。

三、生物因素影響

★  酶解：核酸酶可以催化水解多聚核苷酸鏈中的磷酸二酯鍵，直接破壞核酸的一級結(jié)構(gòu)，使其降解。

1.核酸酶(磷酸二酯酶)

核酸內(nèi)切酶：在環(huán)境或生物體內(nèi)具有識別雙鏈DNA分子中特定核苷酸序列，并由此切割DNA雙鏈的核酸內(nèi)切酶統(tǒng)稱為限制性核酸內(nèi)切酶。作用方式從多聚核苷酸鏈中間開始，在某一個位點切斷磷酸二酯鍵。如DNase，RNase等。

核酸外切酶：核酸外切酶的作用方式是從多聚核苷酸鏈的一端(3'-端或5'-端)開始，逐個水解切除核苷酸。如蛇毒磷酸二酯酶，牛脾磷酸二酯酶等。

2.核苷酸酶(磷酸單酯酶)

專一性的磷酸單酯酶：3'-核苷酸酶，5'-核苷酸酶

非專一性磷酸單酯酶。

★  微生物侵染：微生物會將DNA作為營養(yǎng)物質(zhì)或是其分泌的化學物質(zhì)含酶。

   預防降解的方法   

預防RNA降解的方法:

★ 去除環(huán)境中RNase酶的污染或強有力地抑制其活性。

★ 獲取樣品后最好立即提取RNA，若無條件立即實驗，應于-80℃液氮中保存樣品，提取時取出樣品后立即在低溫下研磨裂解細胞，以防RNA降解。

★ 在總RNA提取分離的最初階段，聯(lián)合使用Rnase的特異抑制劑，盡可能的滅活胞內(nèi)的Rnase的活性。

★ 避免樣品的反復凍融。

★ 保證裂解液的質(zhì)量，裂解液的用量不足，也會導致RNA降解。

★ RNA提取后，放入-80℃保存，防止降解。

預防DNA降解的方法:

★ 簡化操作步驟，縮短提取過程，以減少各種有害因素對核酸的破壞；

★ 減少化學物質(zhì)對DNA的降解，為避免過酸、過堿對DNA雙鏈中磷酸二酯鍵的破壞；

★ 防止基因組DNA的生物降解，主要是DNase降解基因組DNA，Dnase需要二價金屬陽離子Mg2+等的激活，可用EDTA等金屬離子整合劑整合Mg2+以抑制Dnase的活性；

★ 減少物理因素對DNA的降解，物理降解因素主要包括機械剪切力(如劇烈震蕩、攪拌等)；

★ 避免樣品的反復凍融，可將DNA分裝保存于緩存液中；

★ 所有試劑應用無菌水配制，耗材經(jīng)高溫滅菌；

★ 避免DNA的過高溫處理等。