關于實時熒光定量PCR技術，最常見的應用是通過RT-qPCR進行基因表達分析、疾病診斷和管理（如病毒定量）、食品檢測（如轉基因或過敏原分析）以及動物或植物育種等研究。這種方法非常靈敏，因此為了得到可靠的實驗數據，避免錯誤是十分重要的。RT和qPCR數據評估的整個工作流程包括以下幾點：

1、實驗設計

2、樣品的制備和提取/純化

3、RT和qPCR

4、數據評估

在以上過程中，實驗人員有可能因為操作錯誤或失誤導致實驗數據的失真。但往往有些錯誤的來源又十分不明確，所以排除故障的第一步是需要再次檢查實驗流程并重復實驗。
 

實驗設計

RT或qPCR反應的第一個重要步驟是測定PCR產物及驗證相應的引物和探針。實時RT-qPCR引物和探針最有效的設計是使用引物設計軟件，大多數軟件都可以調整設置參數的最佳屬性，以檢索到符合要求的引物探針序列。這些設置參數考慮熔化溫度Tm、互補性、二級結構以及擴增子大小和其他重要因素。同時建議跨內含子設計引物，避免來自gDNA的干擾，直接得到cDNA片段。對于基因特異性引物的設計，應滿足以下標準：

擴增子大小: 75-200 bp

引物長度: 18-30 bp

GC 含量: 40-60%

解鏈溫度: 55-60℃

3' 端: 1-2 G or C，以具有良好的穩定性

不超過3個G or C （可能不匹配）

沒有二級結構，重復序列或回文結構

濃度: 150-200 nM

樣品的制備和提取/純化

模板的質量直接影響到檢測性能，在qPCR結果的故障排除過程中也需要考慮。首先，組織取樣和保存是實驗可變性的第一個潛在來源。對于基因的定量，必須使用高質量的RNA，這意味著需要非常仔細地檢查RNA的濃度和質量。

降解或不純的RNA會限制逆轉錄反應的效率，降低產量；部分降解的RNA可能不能給出準確的基因表達結果。核酸應從新鮮或立即冷凍的組織中提取和純化；同時建議使用生物學重復（至少3個）。RNA或DNA的分離是PCR實驗前的關鍵步驟。這是必要的，以便提取對所有樣本都是有效的，并得到純化的核酸（DNA，RNA）。可采用高分辨率瓊脂糖凝膠檢測核酸質量和分光光度法（A260/A280=1.8和A260/A230=2.0）檢測核酸純度。關于核酸的質控可查看以下兩篇文章以供參考：

    

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另外也要注意，用于PCR制備的工作空間所有臺面及物品都應進行常規去污，以防止交叉污染。
 

逆轉錄和實時熒光定量PCR

RT-qPCR是一種分析DNA或RNA的高靈敏性工具。當PCR擴增靶標時，錯誤同時被放大。可以通過標準化和盡量減少移液步驟來減少PCR反應中的技術錯誤；在無灰塵的干凈環境中建立反應；通過對無模板（水）對照進行PCR反應，常規檢查引物和試劑庫存的DNA污染等。

在進行qPCR時可能會出現以下故障：沒有擴增、qPCR效率多大或過小、Cq值過大、重復性差、擴增曲線異常、非特異性擴增等等。遇到這些問題應該怎么解決呢，查看以下文章，問題迎刃而解：
 

     

運行后的數據分析-基線和閾值的設置

基線校正是去除背景熒光的必要條件。可能的原因是qPCR設備的檢測器噪音，或是不同的樣品量或染料（探針或插入染料）的殘留熒光。所有樣本的基線起點一般從0~3個循環開始進行量化，基線終點是在各個擴增曲線起峰位置前的1~2個循環。為了使實時RT-qPCR數據有意義，應在擴增曲線的指數擴增階段設置閾值，閾值自動設置一般是基線期熒光信號標準偏差的10倍。
 

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