基因組編輯

基因表達調控的方式有很多種，但不外乎在DNA水平、RNA或蛋白質水平進行調控。多數的方式僅能對基因進行高效的、瞬時的調控，這在某些應用場景下非常有優(yōu)勢。也可以通過質粒、轉座子、病毒的隨機整合或同源重組完成穩(wěn)定的和可遺傳的DNA修飾。但是，要實現位點特異性的整合是非常耗時且困難的。隨著先進的基因組編輯工具不斷被發(fā)現，位點特異性穩(wěn)定修飾變得更容易實現。

在過去的十年中，鋅指核酸酶（ZFN）和轉錄激活因子樣效應核酸酶（TALEN）技術被確立為位點特異性基因組修飾的有用工具，但隨著最近規(guī)律間隔成簇短回文重復序列（CRISPR）技術的出現，它成為了另一種有效的替代方案。

通過基因組編輯靶向修飾細胞DNA為基礎生物學研究、早期藥物發(fā)現和新型細胞療法（例如免疫療法）的開發(fā)提供了強有力的工具。

CRISPR技術利用工程化核酸酶在靶基因組位置刪除、插入或替換基因（Gaj et al., 2013）。Cas9核酸酶在基因組DNA中產生雙鏈斷裂，從而誘導兩種可能的細胞修復過程：1.非同源末端連接（NHEJ）可導致功能基因的缺失，因為它在關閉斷裂時通常伴隨突變。2.如果可獲得部分同源供體序列，則可通過同源依賴性修復（HDR）進行基因的插入或替換。為了在特定靶序列上進行這種修飾，核酸酶與序列特異性DNA結合，將核酸酶導向靶序列。

基因組編輯工具

如上所述，對于基因組編輯，工程化核酸酶用于在靶基因組特定位置刪除，插入或替換基因。這種工程化核酸酶通常由兩個元件組成：內切核酸酶DNA切割模塊和序列特異性DNA結合結構域。核酸酶切割雙鏈DNA，產生雙鏈斷裂（DSB）。DSB誘導細胞DNA修復過程。這可能會發(fā)生兩種類型的修復過程，1.如果沒有可用的同源供體片段-無論是相應的等位基因還是外部供體DNA-斷裂的末端將被重新連接。該過程稱為非同源末端連接（NHEJ），并且通常可能導致基因功能元件缺失的突變。

如果存在同源的序列，例如基因組等位基因或外源供體DNA，則可以通過同源重組修復（HDR）進行基因的插入或替換。NHEJ與HDR的頻率取決于實驗設置，例如細胞類型和供體量。

這些核酸酶與序列特異性DNA結合結構域的組合可以定制以識別幾乎任何序列，以位點特異性的方式進行基因組編輯。

常用的位點特異性的基因組編輯工具有以下三種：

·   ZFN

·   TALEN

·   CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9

CRISPR技術來源于細菌防御病毒入侵的途徑，目前已經廣泛地應用于真核生物的基因組編輯。相較于ZFN和TALEN，它更具有靈活性。

與ZFN和TALEN相比（詳見下文），基于CRISPR的基因組編輯依賴于兩個獨立的組件一起工作：

DNA靶向部分: 所謂的靶向RNA（gRNA），通常與18-21bp的基因組DNA片段互補。

Cas9核酸酶：一旦gRNA與基因組DNA鏈配對，Cas9核酸酶就會切割基因組DNA，引起雙鏈斷裂。

由于DNA特異性部分是RNA分子，因此比ZF-或TALE-核酸酶融合蛋白更容易設計和生產。此外，通過將Cas9核酸酶與靶向不同位點的幾種gRNA一起轉移，可以進行多基因組編輯。

· 轉入一個同時包含gRNA和Cas9核酸酶的質粒

· 共轉入兩個單獨的質粒（一個含有gRNA，另一個包含Cas9）

· 共轉一個包含Cas9的質粒和一個可以表達gRNA的PCR序列

· 體外組合的Cas9-gRNA的RNP復合物

· 如果是為了插入或替換，還需要再共轉一個供體DNA質粒或一個單鏈核苷酸（ssODN）

ZFN

鋅指（ZF）蛋白是自然界中最豐富和最通用的DNA結合結構域(Tupler R et al., 2001)。單個鋅指結構域結合3個DNA堿基對。由于它們的模塊化結構，它們?yōu)樵O計人工序列特異性結合分子提供了理想的框架。ZF與內切核酸酶（主要是Fok1）的融合構建了鋅指核酸酶（ZFN）。兩種這樣的ZFN組合起作用以結合靶DNA序列的有義和反義鏈。結合后，Fok1核酸酶形成活性二聚體并誘導雙鏈斷裂，引起隨后的細胞修復過程。

TALEN

2009年，科學家們發(fā)現轉錄激活因子樣效應子（TALEs）可作為更簡單的模塊化DNA識別蛋白(Boch et al., 2009; Moscou et al., 2009)。TALE是來自植物病原菌屬Xanthomonas天然存在的蛋白質，并且含有DNA結合重復序列，每個重復序列識別單個堿基對。與鋅指的基于三聯體的DNA結合相比，TALE-DNA結合重復的這種單堿基識別模式使得設計具有更大的靈活性，但也存在一些克隆挑戰(zhàn)。同樣，工程化的TALE通常與Fok1核酸酶融合以構建TALE核酸酶融合物（TALEN）。與ZFN一樣，必須為每個靶標產生一對TALEN，每個單體結合(Jinek et al., 2013) 靶DNA的有義或反義鏈。