還原型谷胱甘肽（reduced glutathione, GSH）試劑盒說明書

分光光度法 50 管/48 樣

注意：正式測定之前選擇 2-3 個預期差異大的樣本做預測定。

測定意義：

GSH 是細胞內最主要的抗氧化巰基物質，在抗氧化、蛋白質巰基保護和氨基酸跨膜運輸等中具有重要作用。還原型與氧化型比值（GSH/GSSG）是細胞氧化還原狀態的主要動態指標。因此，測定細胞內 GSH 和 GSSG 含量以及 GSH/GSSG 比值，能夠很好地反映細胞所處的氧化還原狀態。

測定原理：

DTNB 與 GSH 反應生成復合物，在 412nm 處有特征吸收峰；其吸光度與 GSH 含量成正比。

自備儀器和用品：

可見分光光度計、低溫離心機、水浴鍋、可調節移液器、1mL 玻璃比色皿和蒸餾水。

試劑組成和配制：

試劑一：液體×1 瓶，4℃保存。

試劑二：液體×1 瓶，4℃保存。

試劑三：液體×1 瓶，4℃避光保存。

粗酶液提取：

1. 組織：按照組織質量（g）：試劑一體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 試劑一）進行冰浴勻漿。8000g，4℃離心 10min，取上清置冰上待測。

2. 細菌、真菌：按照細胞數量（104 個）：試劑一體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細胞加入 1mL 試劑一），冰浴超聲波破碎細胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7秒，總時間 3min）；然后 8000g，4℃，離心 10min，取上清置于冰上待測。

3. 血清等液體：直接測定。

GSH 測定操作：

1. 分光光度計預熱 30min，調節波長到 412 nm，蒸餾水調零。

2. 試劑二置于 25℃（一般物種）或者 37℃（哺乳動物）水浴中保溫 30min。

3. 空白管：取 1mL 玻璃比色皿，依次加入 100μL 蒸餾水，700μL 試劑二，200μL 試劑三， 混勻靜置 2min 后測定 412 nm 吸光度 A1。

4. 測定管：取 1mL 玻璃比色皿，依次加入 100μL 上清液，700μL 試劑二，200μL 試劑三， 混勻靜置 2min 后測定 412 nm 吸光度 A2。

注意：空白管只需要測定一次。

GSH 含量計算公式：

GSH 標準曲線公式：y=1.5 x（x 為 GSH 濃度，μ mol /mL；y 為吸光值）

GSH 計算：

（1） 按蛋白濃度計算

GSH（μ mol/ mg prot）=(A2－A1) ÷1.5×V 樣÷（V 樣×Cpr ）=0.667×(A2－A1) ÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計算

GSH（μ mol/g 鮮重）=(A2－A1) ÷1.5×V 樣÷(V 樣÷V 樣總×W)=0.667×(A2－A1) ÷W

（3） 按細胞數量計算

GSH（μ mol /104 cell）=(A2－A1) ÷1.5×V 樣÷(V 樣÷V 樣總×細胞數量)=0.667×(A2－A1) ÷細胞數量（4） 按液體體積計算

GSH（μ mol/ mL）=(A2－A1) ÷1.5×V 樣÷V 樣 =0.667×(A2－A1)

V 樣總：上清液總體積，1 mL；V 樣：加入反應體系中上清液體積，100μL=0.1 mL；W： 樣品質量，g ；Cpr：上清液蛋白質濃度，mg/mL；

注意事項：

1. 試劑一中含有蛋白質沉淀劑，因此上清液不能用于蛋白濃度測定。

2. 最低檢出限為 0.01mmol/L。