外周血單個核細胞（PBMC）在免疫學、傳染病、腫瘤學、干細胞移植、惡性血液腫瘤以及疫苗開發等領域被廣泛的研究，尤其是在免疫學領域，PBMC細胞被用來監測在不同患者之間的免疫功能，其監測濃度、活力、增值、細胞因子的功能，對于臨床試驗和細胞醫學研究都是是至關重要的。

PBMC通常從分離于全血或者采集于病人的臍帶血，這個過程就需要使用淋巴細胞分離液從血漿，血小板，和紅細胞（RBC）中分離PBMC。分離之后，冷凍保存之前或者各種免疫分析都需要進行常規的活性和濃度測驗來驗證樣品的質量。

其中一個重要的問題就是PBMC細胞分離中紅細胞的污染，PBMC樣品中紅細胞的污染會導致測量濃度和活性的誤差，這就需要通過進一步的實驗來分析這些細胞，要解決這個問題，可以用RBC溶解來消除潛在的RBC污染導致的問題。

 

1、新鮮的人類PBMC樣品殘留RBC的鑒定

用Cellometer Vision細胞計數儀明場圖像計數15個分離的新鮮白細胞樣品，獨特的光學系統使得紅細胞的雙凹面可視化，因此PBMC和RBC被視覺化然后圖像計數。因此PBMC和RBC可以被視覺識別，然后根據圖像計數。

下圖顯示的是明場計數的PBMC樣品，紅色圈圈出雙凹面的紅細胞，藍色圈圈出PBMC

          

VISION CBA調焦，紅細胞雙凹面結構明場圖像         熒光染料染PBMC確認，紅箭頭為雙凹的紅細胞，綠箭頭為PBMC

 

紅色圈圈出紅細胞，藍色圈圈出PBMC

 

RBC的污染程度用公式計算：污染率%=RBC計數/總計數×100%

結果顯示4個樣品高度污染（超過30%），6個樣品中度污染（介于10%-30%），4個樣品低輕度污染（低于10%）。

 

2、AO/PI雙染活/死細胞進行自動計數

AO和PI是熒光核酸染料，檢測細胞的活性。AO是一種細胞膜透過性染料，染總細胞，發綠色熒光;，PI不具有細胞膜通透性，染死細胞，發橙/紅色熒光。當死細胞同時包含了AO和PI，發生熒光共振能量轉移，AO發散的熒光被PI吸收，因此，只有活細胞才發綠色熒光。此外，成熟的血小板和紅細胞是無核的，不能被熒光染料著色，完全排除。AO/PI混合液20ul和白細胞樣品20ul，按照1：1的比例混合，通過Cellometer細胞計數儀計數PBMC濃度。

 

3、通過AO/PI檢測PBMC細胞活力

為了驗證AO/PI雙染法精確計數總PBMC，從全血中分離了5個新鮮的白細胞樣品，3%的醋酸溶解，然后臺盼藍染色人工計數對比AO/PI雙染法

樣品A：加AO/PI，然后直接通過Cellometer雙熒光細胞計數儀進行自動計數

樣品B：3%的醋酸裂解紅細胞，然后臺盼藍染色，計數。

兩種方法對比，結果顯示，AO/PI雙染法能夠不用裂解RBC進行總PBMC計數和活力分析。

 

 

4、AO/PI雙染色法排除RBC污染導致的計數誤差

使用血球計數板手工計數和AO/PI雙染自動計數兩種方法，進行15個PBMC樣品的計數。其中手工計數的操作者為經驗豐富的計數方面專家，可以憑豐富的經驗及不斷微調顯微鏡焦距區 分出紅細胞和PBMC。

 

如圖所示，手工計數法為藍色柱條，AO/PI雙染自動計數法為綠色柱條。AO/PI雙染法沒有受到高度RBC污染的影響，可以精確計數PBMC。而手工計數需要靠經驗豐富的操作者一個一個的判斷紅細胞和PBMC。此結果顯示AO/PI雙染自動計數和經驗豐富的操作者進行的手工計數計數PBMC的結果一致。

同時，15個樣本中分離的結果差異很大，不同人尤其不同病人分離后紅細胞RBC污染的差異大。

 

RBC污染極大的影響PBMC樣品的濃度和活性的精確性，RBC污染的程度在不同病人之間有差異，標準的PBMC處理protocol無法區分，只有AOPI雙熒光自動細胞計數儀能夠快速、高效、精確進行PBMC計數和活力分析，有助于免疫學的研究。

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