賈偉  沃特世科技（上海）有限公司實驗中心

 

在生物藥肽圖分析、蛋白質修飾分析、蛋白質組學研究等諸多工作中，蛋白質的變性與酶解是樣品處理的必經之路。RapiGestTM SF正是在這個實驗步驟中，用以輔助蛋白酶解的變性試劑[^1,2,3]。RapiGest SF有以下優點：

■ 綜合水相、有機相溶液條件下，最高效的輔助酶解變性劑。

■ 作用過程中，不對蛋白造成副反應化學修飾。

■ 操作簡單、全面適應液質分析方法。

■ 常規操作濃度對胰蛋白酶活性無抑制。

■ 可大大縮短酶解反應時間。

■ 對各種蛋白酶、肽-N糖苷酶等多種酶解過程都適用。

 

在蛋白質質譜分析的大部分工作中，常常需要將蛋白質酶解為多肽進行分析。但蛋白質結構是以三維結構的形式存在的，為了將蛋白高級結構內部的酶切位點暴露于蛋白酶的作用下，首先需要對蛋白進行變性，使蛋白舒展開。John R. Yates教授領導的團隊對各種變性劑中的輔助酶切效果進行了充分比較，其中RapiGest SF的表現最為優秀（圖1）^[4]。仔細觀察圖1還可以發現，在實驗結果中，較為常用的尿素輔助酶切效率較差。這是由于尿素對胰蛋白酶活性的抑制作用較大。實驗人員有時會采取使用尿素進行蛋白后，將反映溶液稀釋10倍，再加入胰蛋白酶的方法，以降低尿素濃度到1M以下，減少其對胰蛋白酶的抑制。但是，面對微量的生物蛋白樣本，稀釋后的體系，會大幅度降低樣品濃度，限制了后續的分析工作。此外，尿素在對蛋白變性的過程中，還會對蛋白進行一定的化學修飾，如氨基甲酰化。副反應的發生對于多肽鑒定、組學水平蛋白定量會造成一定的影響與誤差。而使用RapiGest SF無副反應的問題，正常使用濃度下(0.1%)對胰蛋白酶活

性也無影響（表1）。

圖1. Tris水相緩沖體系下各種變性劑的輔助酶切效果比較。樣品為mammalian cell lysate cytoplasmic fraction蛋白。

檢測基于胰蛋白酶誘導N-α-苯甲酰-L-精氨酸乙基乙酯（BAEE）水解。將0.5微克胰蛋白酶加入1mL 50mM的碳酸氫銨溶液中（pH 7.9，0.2 mM BAEE）。檢測△BAEE在253 nm下的吸收值（5分鐘內的斜率）。

 

RapiGest SF雖然是一種表面活性劑，但其全面適應液質分析的要求。在使用RapiGest SF作為變性劑完成蛋白酶切后，如果只進行色譜分析，則可無需對RapiGest SF進行處理。如進行液質聯用分析，則通過簡單的加酸步驟就可將RapiGest SF去除。而酸性溶液環境又恰恰是液質分析所需的樣品溶液環境。事實上，RapiGest SF是酸性不穩定表面活性劑，在酸性條件下（pH2）極易水解。RapiGestSF的結構及其水解產物見圖2。酸化后RapiGest SF降解為兩個產物：2-十二酮和3-羥（2,3-二羥基丙基）丙磺酸鈉。前者與水不能互溶，通過離心去除。后者在水溶液中溶解度很高，在反相LC模式下不保留。因此，酶消解后的水溶液可直接進行LC-MS或MALDI-MS分析。

圖 2. RapiGest SF在酸性溶液中的降解產物。

 

圖3為Ra piGest SF輔助的人單抗酶解的實例。通過BiopharmaLynxTM軟件分析，其序列覆蓋度為98%。而且LC/MS分析中沒有發現錯誤酶切的多肽或完整未被酶切的蛋白。2%序列未發現的原因是由于此部分序列為2個氨基酸的超短肽或單個氨基酸（R或K），其無法在反相柱上保留。

圖 3.LC-MS分析RapiGest SF輔助下的人單抗胰蛋白酶酶解多肽。

 

由于其表面活性劑的屬性，RapiGest SF可以非常快速地對蛋白完成變性，從而縮短酶解實驗時間。圖4顯示，RapiGest SF輔助下，完全酶解馬肌紅蛋白只需要5分鐘。而由于肌紅蛋白屬球蛋白，其在不充分變性的情況下將難以酶解。在對照反應中，單純與胰蛋白酶孵育條件下，即使到9小時后，仍只有少量的蛋白被酶解；而使用了RapiGest SF試劑的體系，酶解效率顯著提升。

 

圖 4.有無RapiGest SF輔助下，馬肌紅酶解效果對比。

 

RapiGest SF自2002年推出以來，已經過10年的使用，它良好的性能被廣泛認可，對各種蛋白酶、肽-N糖苷酶等多種酶解過程都適用^[5]。RapiGest SF已經成為大部分生物質譜科學家的常規必備試劑。

 

(1) Yu YQ, Gilar M, Lee PJ, Bouvier ES, Gebler JC. Enzyme-friendly,mass spectrometry-compatible surfactant for in-solution enzymatic digestion of proteins. Anal. Chem. 2003, 75, 6023-6028.

(2) Huang HZ, Nic hols A, Liu DJ. Direct identification and quantification of aspartyl succinimide in an IgG2 mAb by RapiGest SF assisted digestion. Anal. Chem. 2009, 81, 1686-1692.

(3) Yu YQ, Gilar M, Lee PJ, Bouvier ES, Gebler JC. A complete peptide mapping of membrane proteins: a novel surfactant aiding the enzymatic digestion of bacteriorhodopsin. Rapid Commun. Mass Spectrom. 2004, 18, 711-715.

(4) Chen EI, Cociorva D, Norris JL, Yates JR 3rd. Optimization of Mass Spectrometry-Compatible Surfactants for Shotgun Proteomics. J Proteome Res. 2007, 6, 2529-2538.

(5) Yu YQ, Gilar M, Kaska J, Gebler JC. A rapid sample preparation method for mass spectrometryc haracterization of N-linked glycans. Rapid Commun. Mass Spectrom. 2005, 19, 2331-2336.