全內反射熒光顯微鏡（TIRFM）是一門非常復雜的光學技術，目前已經被細胞生物學家和神經科學家廣泛應用，成為了細胞-基底接觸區域內的豐富的細胞生命活動最強有力的探測方法。如細胞膜內蛋白質的動力學過程，基底附近的細胞骨架，細胞運動等。

TIRFM技術依賴于斜射光線在兩種不同折射率光學介質表面產生的極淺的消逝波。該效應產生的條件是入射介質折射率大于折射介質，并且斜射照射到光學界面時入射角大于全反射臨界角。

TIRFM分為棱鏡型和物鏡型。棱鏡型TIRF顯微鏡采用棱鏡產生衰逝波，并用物鏡收集熒光成像。但棱鏡型TIRFM需要在標本上方安裝價格昂貴的棱鏡系統，而且安裝棱鏡還會使透射光觀察技術受限制，并會造成標本振動。而對物鏡型TIRFM而言，則可以克服以上缺點。物鏡型TIRFM的物鏡既作為收集樣品熒光信號的接受器，同時又作為發生全反射的光學器件。因此高數值孔徑的物鏡的使用是物鏡型全內反射熒光成像系統的關鍵。

由于細胞的典型折射率為1.33~1.38，因此要實現全內反射，在物鏡型全內反射熒光成像系統中物鏡的數值孔徑（NA）必須大于1.38（NA=nsinθ; nsinθ>nsinθc ；n,θ 分別為物鏡的折射率和孔徑角；θc為發生全內反射的臨界角）。當物鏡數值孔徑為1.4時，只有很小的一部分數值孔徑范圍（1.4-1.38=0.02）被利用，入射角可調節范圍（最大孔徑角與全內反射角的差值）很小，光束校準比較難，同時光束的強度也很難提高。若使用數值孔徑為1.65的物鏡，則有一個大的多的孔徑范圍（1.65-1.38=0.27）可以被利用，則入射角可調節范圍變大，降低了操作難度。

奧林巴斯提供的TIRFM物鏡，包括了數值孔徑1.69的最高分辨率的特殊物（APO100XOHR），這意味著TIRFM能夠在小于40納米深度實施觀察。100倍物鏡（UAPON 100xO TIRF）和60倍 物鏡（APON 60xO TIRF），其數值孔徑更是分別達到了1.65、1.49，其明場熒光顯微鏡的亮度比傳統100Xoil/1.4N.A. 物鏡提高了28%，分辨率也由0.240μm提高到0.203μm，為單分子影像觀察提供更明亮和更佳的對比度。此外150倍的高倍率高數值孔徑的物鏡(UAPON 150xO TIRF)適用于340nm紫外透射，可應用在紫外激發熒光染料的TIRFM成像中。

Effect of the Apo100XOHR(N.A.: 1.65):

Single molecule fluorescence image of the Tetramethyl rhodamine