采用快速循環熒光定量PCR儀和LightScanner32上的非標記探針進行MAAB
簡介
高分辨率熔解曲線可以通過掃描PCR的擴增片斷來檢測雜合體中基因序列的變化。配合使用高分辨的飽和熒光染料，在檢測小于400bp的PCR片斷的SNP、插入或缺失時的靈敏度可達98%以上。該方法自開發以來，被不斷的應用于新的領域，如采用小片段擴增法和非標記探針法（LunaProbes）對已知序列進行基因分型。非標記探針的3’ 端被封閉，以防止PCR過程中的擴增，采用雙鏈DNA的飽和染料LCGreen Plus和非標記探針（LunaProbes）熔解溫度的不同（Tm值）來區分不同的基因型。非標記探針可用于基因分型中等位基因的定量，可以檢測出突變率≦10%的等位基因的突變。
最近，一種基于快速循環熒光定量PCR儀和LightScanner32上的非標記探針的高分辨率熔解曲線分析，進行突變體等位基因的偏向性擴增（MAAB）的方法被開發的了出來，該方法可以增加非標記探針在檢測等位基因突變中的靈敏度。
最近，一種基于快速循環熒光定量PCR儀和LightScanner32上的非標記探針的高分辨率熔解曲線分析，進行突變體等位基因的偏向性擴增（MAAB）的方法被開發的了出來，該方法可以增加非標記探針在檢測等位基因突變中的靈敏度。
Mutant Allele Amplification Bias（MAAB）原理
非標記探針的3’ 端被封閉，以防止PCR過程中的擴增。探針的設計和野生型等位基因完全互補，和突變的等位基因位點不完全互補。突變的等位基因的偏向性擴增主要是通過設定PCR反應的退火溫度來實現的。PCR的退火溫度要低于野生型等位基因探針的退火溫度而高于突變體等位基因的退火溫度，介于完全互補的探針（野生型位點）Tm值和非完全互補的探針（突變體的位點）Tm值之間。在該退火溫度下，完全互補的探針和目標DNA鏈仍然結合在一起（Figure1a），因而抑制野生型序列的PCR反應（Figure1b），從而實現突變體等位基因的偏向性擴增。
方法
用非標記探針在野生型等位基因的背景下檢測突變率≦1%的等位基因的突變，使用了不同的退火溫度和不同的核酸外切酶。選用3個不同的基因用于檢測：TP53（exon 8）與癌癥相關的突變，PAH（exon 11）與PKU（苯丙酮尿癥）相關的突變，還有一個與瘧疾相關基因的對藥物療法具有抗性的突變，然后使用普通的熱啟動PCR儀做溫度梯度PCR，來確定非標記探針的Tm值和普通的熱啟動PCR儀是否可以完成MAAB。
結果
核酸外切酶postive（NEB和Roche FastStart）沒有出現MAAB（65-75℃）（圖2）。
使用非標記探針在沒有MAAB時對每一個目的基因檢測突變的等位基因的靈敏度在5-10%(圖3)。
使用熱啟動PCR儀做溫度梯度時，TP53 x8和PAH x11有MAAB（圖4左）。但是瘧疾相關基因在熱啟動的定量PCR儀器上沒有表現出突變的等位基因的加強（圖4右）。
之后采用快速循環熒光定量PCR儀和LightScanner32上的非標記探針的高分辨率熔解曲線，采用溫度梯度進行突變體等位基因的偏向性擴增。與使用普通的熱啟動PCR儀相比，使用快速定量PCR儀，退火溫度56℃時對MAAB有明顯的影響。將純合的WT和突變的等位基因混合（50/50），證實了對突變的等位基因的檢出率可以在1%以下（圖5）。
圖 5. LunaProbes的標準化差異峰. 野生型的等位基因位點（灰色）= 62ºC，突變型的等位基因位點（紅色）= 54ºC。58ºC作為退火溫度來進行50–50的混合樣品（黃色）的突變等位基因的差異性擴增。這種擴增方法使得差異擴增的分辨率達到10倍，并且使得檢測的靈敏性到0.7–1.5%
這一結果證實了使用非標記探針的MAAB比沒有MAAB的檢測的靈敏度要高。
結論
以下是使用非標記探針進行MAAB的重要參數：
1.溫度轉換率和PCR目的片度的溫度
2.退火溫度和探針的Tm值
3.核酸外切酶
1.溫度轉換率和PCR目的片度的溫度
2.退火溫度和探針的Tm值
3.核酸外切酶
注意這幾個重要的參數后，本研究中對突變的等位基因的檢測率可以達到1%，應用這種方法檢測已知的體細胞突變（p53，EGFR, BRAF），提早發現寄生蟲感染避免藥物治療不當，高靈敏度檢測胎兒DNA突變。在LS32上進行定量PCR及高分辨溶解曲線分析，結合使用使用快速定量PCR方法和非標記探針對于MAAB至關重要。
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