Real Time PCR—Cycleave PCR法原理
| ■ CycleavePCR法原理 |
| CycleavePCR法是由RNA和DNA構(gòu)成的雜合Cycling 探針與RNase H組合使用的高靈敏度檢測方法，能夠高效率地檢出目的基因。Cycling 探針內(nèi)部夾有RNA部分，5′端標(biāo)記熒光物質(zhì)，3′端標(biāo)記淬滅物質(zhì)，當(dāng)探針處于完整狀態(tài)時(shí)，由于熒光淬滅作用抑制熒光物質(zhì)發(fā)出熒光，但當(dāng)探針與擴(kuò)增產(chǎn)物中的互補(bǔ)序列雜交后，RNase H在RNA部分將探針切斷，淬滅抑制作用解除，熒光物質(zhì)發(fā)出熒光，通過測定熒光強(qiáng)度，能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測擴(kuò)增產(chǎn)物量。如果探針的RNA部分或與RNA部分相鄰的2 ~ 3個(gè)堿基與模板不互補(bǔ)，RNase H就不能在RNA部分將探針切斷，所以該檢出方法是一種即使一堿基不同也能識別的高特異性檢出方法，特別適合于SNP解析。 Cycling 探針堿基數(shù)少，一般為十二個(gè)堿基左右，熒光報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的距離近，淬滅效果好，熒光背景低，信噪比高。具體原理詳見圖1： |
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| 圖1 Cycling 探針法原理 |
| ■ 利用CycleavePCR法的SNP解析原理 |
| CycleavePCR法在SNP分型解析方面具有強(qiáng)大的優(yōu)勢。使用CycleavePCR法進(jìn)行SNP解析，在設(shè)計(jì)探針時(shí)，把多型位點(diǎn)或與其相鄰的第2 ~ 3個(gè)堿基設(shè)計(jì)成RNA，使用不同的熒光物質(zhì)分別標(biāo)記野生型和突變型探針，通過對兩種不同熒光物質(zhì)進(jìn)行雙通道同步檢測，實(shí)現(xiàn)對每個(gè)檢測樣品的SNP位點(diǎn)的基因型判定。 |
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