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從樣品到WB的磷酸化蛋白檢測操作技巧

瀏覽次數(shù):355 發(fā)布日期:2025-6-6  來源:本站 僅供參考,謝絕轉載,否則責任自負

你的磷酸化抗體,可能正在毀掉實驗?
蛋白磷酸化作為信號通路研究的 "黃金指標",其檢測堪稱科研人必修的 "顯微鏡級" 技術活。Western blot 雖為常規(guī)手段,但磷酸化檢測的特殊性,讓每個環(huán)節(jié)都藏著 "翻車風險"。今天就來拆解這套 "高難度動作" 的正確打開方式 ——

一、解碼樣品:先摸清磷酸化蛋白的 "脾氣"
磷酸化蛋白往往是細胞里的 "特殊玩家",想讓它們 "現(xiàn)身" 得用點巧勁:

刺激誘導有講究:物理 / 化學刺激是激活磷酸化的常用手段,但時間和強度堪稱 "玄學"—— 查文獻 + 預實驗是唯一捷徑(比如某細胞因子可能需 37℃刺激 15 分鐘才觸發(fā)磷酸化)。

數(shù)據(jù)庫助攻:PhosphoSitePlus 堪稱 "磷酸化百科全書",輸入蛋白名稱即可解鎖其磷酸化位點、修飾頻率等 "隱藏信息"。

對照雙保險:陽性對照(已知磷酸化樣本)和陰性對照(未刺激樣本)必須配齊,否則抗體認沒認錯 "目標" 都難說!

二、蛋白提取:與時間賽跑的 "冰上芭蕾"
核心法則:快準冷 + 抑制劑護體

制樣速度決定成敗:

細胞洗滌用 4℃預冷 PBS,組織研磨請搬出液氮 "速凍",全程讓樣品待在 "冰爽世界",防止磷酸化 "轉瞬即逝"。

抑制劑是 "守護神":

裂解液必須現(xiàn)配現(xiàn)用,蛋白酶抑制劑 + 磷酸酶抑制劑是 "基礎套餐";若檢測酪氨酸磷酸化,1μmol/L 原釩酸鈉是 "隱藏菜單"。

劃重點:部分磷酸化抗體明確禁止煮沸變性(會破壞磷酸化位點),上樣前務必細讀抗體說明書!

保存細節(jié)控:提取后的蛋白盡快分裝成小份,-80℃凍存,反復凍融 = 讓磷酸基團 "離家出走"。

三、內參雙殺:破解磷酸化數(shù)據(jù)的 "密碼本"
為什么別人的結果能發(fā)高分刊?可能贏在了內參設計:

總蛋白內參:比如檢測 p-Akt,必須同時跑 Akt 總蛋白 —— 磷酸化 / 總蛋白的比值變化,才是真正的 "磷酸化水平證據(jù)"。

體系內參:Actin 或 GAPDH 是 "重量監(jiān)督員",確保每孔上樣量一致,不然條帶深淺可能只是 "上樣誤差的障眼法"。

四、WB 操作:磷酸化條帶 "顯影秘籍"

  1. 上樣與抗體的 "劑量博弈"

磷酸化蛋白含量低?每孔可加到 30-50μg 蛋白(普通 WB 約 20μg),給抗體更多 "捕捉目標" 的機會。

抗體選優(yōu)選斯達特:斯達特專有兔單B細胞抗體開發(fā)平臺,重組兔單抗,特意性高,靈敏度高,穩(wěn)定性強,批間一致性好,是您WB 最佳選擇。

  1. 封閉與孵育的 "溫度哲學"

封閉液選 5% BSA(TBST 配制),奶粉可能藏著磷酸酶 "內鬼";封閉 1 小時剛剛好,太久會 "遮住" 抗原表位。

4℃孵育過夜是 "黃金操作":低溫讓蛋白穩(wěn)穩(wěn) "粘" 在膜上,避免高溫導致的抗原脫落(PVDF 膜的物理吸附特性了解一下)。

  1. 洗膜的 "溫柔藝術"

搖床轉速別太猛,洗滌時間別太長 —— 磷酸化蛋白本就 "脆弱",過度沖洗會讓它們 "離家出走"。

斯達特磷酸化多套裝,包含100μl 總蛋白一抗+100μl 磷酸化蛋白一抗,助您輕松檢測蛋白磷酸化。


產品信息


杭州斯達特 (www.starter-bio.com)志在為全球生命科學行業(yè)提供優(yōu)質的抗體、蛋白、試劑盒等產品及研發(fā)服務。依托多個開發(fā)平臺:重組兔單抗、重組鼠單抗、快速鼠單抗、重組蛋白開發(fā)平臺(E.coli,CHO,HEK293,InsectCells),已正式通過歐盟98/79/EC認證、ISO9001認證、ISO13485。

發(fā)布者:杭州斯達特生物科技有限公司
聯(lián)系電話:13774214275
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