在神經科學研究領域，大腦就像一座神秘的城堡，吸引著無數科學家去探索其中的奧秘。然而，長期以來，由于技術的限制，想要清晰地觀察大腦內部的結構和細胞活動，就如同隔著一層迷霧。直到組織透明化技術和相關成像方法的出現，才讓這層迷霧逐漸散去，而iPEGASOS技術更是其中的佼佼者。今天，就讓我們一起走進這一技術的奇妙世界，看看它是如何為大腦成像帶來革命性變化的。
 

研究背景
傳統大腦研究方法的困境
隨著研究的不斷深入，科研人員對多光子成像技術提出了更高的期望。在追求更高分辨率、更大視場、更快成像速度以及更深成像深度的道路上，多光子成像技術不斷演進，逐漸形成了超分辨成像、大視場成像、高速成像和深層成像等多個發展方向。這些發展方向相互交織，共同推動著多光子成像技術向更高水平邁進。

經典的組織學方法，也就是依靠大腦切片來研究大腦結構，一直是解剖神經科學研究的基礎，這種方法存在著諸多問題。一方面，由于組織不透明，光線很難穿透到大腦深層樣本中，為了克服這個問題，科學家們嘗試將二維的大腦切片進行數字化重建，試圖構建出三維的大腦視圖，但可能出現誤差，而且在切片過程中還會對組織造成物理損傷，會影響高分辨率重建的準確性。另一方面，整個切片、安裝、處理和掃描的過程非常繁瑣，不僅耗費大量的人力和時間，還易出錯。

組織透明化技術的興起
其實，組織透明化的嘗試早在一個世紀前就已經開始了，但真正得到廣泛關注和發展，還是得益于成像技術的進步，比如光片顯微鏡的出現，能對整個小鼠大腦這樣的大樣本進行單細胞分辨率的光學掃描。可以通過調整激光束和檢測平面的位置，獲取不同深度的光學切片，最后將這些切片組合起來，形成整個組織的三維重建圖像，讓我們能夠詳細地觀察到樣本內部結構的空間組織。

隨著研究的深入，各種各樣的組織透明化方案不斷涌現。這些方案雖然使用的化學物質不同，但基本原理是相似的，都包括組織固定、脫鈣（如果樣本包含骨頭）、脫色（去除內源性色素）、脫脂（去除脂質）以及折射率匹配（讓樣本和成像介質的折射率一致，以達到最大透明度）等步驟。

iPEGASOS技術的誕生
盡管組織透明化技術取得了很大進展，但目前大多數透明化方案在與免疫標記技術結合時還存在問題。熒光報告基因常被用于可視化感興趣的分子，然而在透明化過程中，基于基因靶向方法的熒光信號強度通常會降低。有時候，即使使用轉基因和病毒輔助基因遞送，熒光信號在透明化后也可能變得非常微弱，甚至無法與背景噪聲區分開來。而且，抗體很難穿透到整個大腦這樣的大組織的深層，限制了全腦標記。

為了解決這些問題，從兩種成熟的方案——iDISCO染色和PEGASOS透明化中汲取靈感，開發出了iPEGASOS技術。不僅能讓組織具有出色的透明度，還能在長達一年的時間里保持強大的熒光信號，并且能夠讓抗體深入穿透大型組織，包括整個小鼠大腦。

iPEGASOS技術的實驗過程
實驗動物準備
在實驗中，研究人員使用了多種成年小鼠。這些小鼠就像是不同的“研究模型”，每一種都有其獨特的特點，為研究提供了多樣化的視角。

iPEGASOS溶液制備：
脫色溶液用于去除樣本中的色素；脫脂溶液能有效去除脂質；染色預處理溶液、通透溶液、封閉溶液、染色溶液等則在免疫染色過程中發揮著關鍵作用，幫助抗體更好地與目標結合；脫水溶液和透明介質則用于脫水和提高樣本透明度，讓大腦樣本變得更加“清澈”。

iPEGASOS被動浸泡程序：
固定后的腦組織要先清洗，然后依次浸泡在脫色溶液、脫脂溶液、通透溶液、封閉溶液、染色溶液中進行免疫染色，之后還要進行第二輪脫脂、脫水和透明化處理，最后才能進行成像。而且，不同大小的樣本在各個步驟中的孵育時間也有所不同，都需要精確控制。

從大腦的背側到腹側，在不同深度的光學切片中都能觀察到豐富而強烈的信號，即使在光學像差最嚴重的腹側部分，也能實現單細胞分辨率成像。通過對這些信號的分析和三維重建，我們能夠清晰地看到VIP神經元細胞體及其相關過程，包括樹突的結構。

實現完整小鼠大腦的神經回路映射
為了深入了解大腦的神經回路，研究人員使用病毒示蹤劑來標記神經回路。iPEGASOS技術在為注射了病毒示蹤劑的大腦提供了出色的信噪比，讓神經元和神經過程都能清晰成像。在這個過程中，不僅能夠觀察到起始細胞和單突觸輸入細胞的位置，還能清晰地看到軸突束和單個軸突的形態，甚至能夠追蹤單個軸突丘腦路徑，這對于理解神經回路的連接和功能具有重要意義。

追蹤阿爾茨海默病小鼠模型中β-淀粉樣蛋白的積累
研究人員使用iPEGASOS技術對小鼠模型進行研究，這是一種快速發展出明顯淀粉樣病理的小鼠模型。通過對不同年齡的小鼠大腦進行免疫染色，使用抗體來檢測β-淀粉樣蛋白的沉積，該技術能夠清晰地捕捉到β-淀粉樣蛋白斑塊在大腦中的分布和隨年齡的變化。從6個月大開始，β-淀粉樣蛋白斑塊就已經出現在整個皮層，隨著年齡的增長，斑塊逐漸積累并擴散到其他腦區。而且，通過對信號強度和斑塊面積的量化分析，進一步證實了該技術在追蹤β-淀粉樣蛋白積累方面的有效性，為研究阿爾茨海默病的發病機制和治療提供了重要的工具。

iPEGASOS技術的優勢突破
保留熒光信號能力強
在小鼠腦切片實驗中，iPEGASOS處理的樣本不僅保留了可見的內源性GFP信號，免疫染色信號強度也更高。這表明iPEGASOS能更好地利用樣本已有的熒光信號，同時增強免疫染色效果。

成本效益和抗體兼容性好
與其他免疫染色策略相比，iPEGASOS采用增強樣本通透性的方法，使用常見且廉價的試劑，與標準的兩步間接熒光免疫染色過程兼容。這使其在成本效益和抗體兼容性方面優勢明顯，且無需特殊實驗設備，降低了實驗門檻。

成像及樣本保存優勢突出
與基于2D切片的3D重建技術相比，iPEGASOS結合光片顯微鏡成像，具有成像時間短、可多次成像、樣本保存時間長等優點。雖然PEGASOS存在組織收縮問題，但iPEGASOS在一定程度上進行了改善，并且能夠對厚組織進行免疫染色，這是許多2D切片技術無法實現的。

實驗總結與展望
盡管iPEGASOS技術已經取得了很大的成功，但仍然有一些問題需要進一步研究。比如，在成像配置方面，雖然研究人員通過實驗證明了成像視角對信號強度的影響不大，但對于一些需要精確比較全腦區域信號強度的研究，還需要探索更好的成像策略，以減少潛在的偏差。此外，隨著神經科學研究的不斷深入，對于大腦結構和功能的研究要求也越來越高。未來，iPEGASOS技術可能會與其他先進技術相結合，進一步提高成像分辨率和對復雜神經回路的解析能力。同時，在研究神經退行性疾病等方面，iPEGASOS技術也有望為藥物研發和治療方案的制定提供更有力的支持。通過這項技術，我們能夠更清晰地觀察大腦的結構和功能，深入了解神經回路的奧秘，為神經科學研究和相關疾病的治療帶來了新的希望。

論文信息
聲明：本文僅用作學術目的。
Gao P, Rivera M, Lin X, Holmes TC, Zhao H, Xu X. Immunolabeling-compatible PEGASOS tissue clearing for high-resolution whole mouse brain imaging. Front Neural Circuits. 2024 Apr 17;18:1345692.
DOI: 10.3389/fncir.2024.1345692.