誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSC）能再分化成特定的細(xì)胞類型、組織和器官，聯(lián)合基因編輯技術(shù)使用，可用于探索疾病發(fā)生的機(jī)制、開發(fā)新型有效的藥物和細(xì)胞治療等。賽業(yè)生物iPSC體外技術(shù)服務(wù)平臺(tái)，擁有成熟的重編程、基因編輯和體外分化技術(shù)，同時(shí)結(jié)合一站式表型分析平臺(tái)，可為客戶打造多種疾病應(yīng)用場(chǎng)景的體外模型構(gòu)建和檢測(cè)服務(wù)。
 

iPSC體外疾病模型研究思路

使用iPSC體外疾病模型的優(yōu)勢(shì)

• 小鼠模型不能完全展現(xiàn)人類疾病的表型與發(fā)生機(jī)制，使用iPSC疾病模型更能模擬人類疾病的發(fā)生。
• 可創(chuàng)造遺傳背景單一的細(xì)胞系，減少因遺傳背景差異而導(dǎo)致的表型變異。
• iPSC在體外可無(wú)限擴(kuò)增和定向分化，有利于大規(guī)模的藥物篩選和替代較難獲得的原代細(xì)胞系。

賽業(yè)生物iPSC體外技術(shù)服務(wù)平臺(tái)

01 iPSC重編程

賽業(yè)生物擁有先進(jìn)的體細(xì)胞重編程技術(shù)，可通過(guò)血液收集體細(xì)胞樣本進(jìn)行重編程，產(chǎn)生高質(zhì)量的人iPS細(xì)胞，成功率高達(dá)99%。我們采用穩(wěn)定的附加型質(zhì)粒重編程方法，非整合，不影響下游實(shí)驗(yàn)；同時(shí)具有標(biāo)準(zhǔn)化操作流程兼容多種培養(yǎng)體系，可大規(guī)模生產(chǎn)高純度細(xì)胞。

細(xì)胞形態(tài)

核型檢測(cè)

STR分型檢測(cè)

細(xì)胞特異性標(biāo)志物

流式檢測(cè)

畸胎瘤驗(yàn)證

02 iPSC基因編輯

       隨著基因編輯技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，對(duì)患者的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞進(jìn)行基因編輯，校正致病基因的突變并用于細(xì)胞治療正成為轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)和再生醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。賽業(yè)生物擁有優(yōu)化升級(jí)的iPSC基因編輯體系，遞送載體HDR效率高達(dá)50%，轉(zhuǎn)染效率>50%，轉(zhuǎn)染活率>80%。
       且由強(qiáng)大的AI算法賦能：罕見病數(shù)據(jù)中心（RDDC）開發(fā)的RNA剪接模型工具提供支持，可輔助篩選WB陰性克隆；基于Smart-CRISPR™細(xì)胞基因編輯系統(tǒng)，輕松實(shí)現(xiàn)基因敲除、基因敲入等多種策略，編輯效率高達(dá)90%。

       通過(guò)基因編輯技術(shù)，在誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞iPSC中的AAVS1位點(diǎn)敲入EGFP基因。如圖所示，通過(guò)RNP法將sgRNA和donor轉(zhuǎn)染到iPSC中，經(jīng)過(guò)HDR途徑將EGFP序列插入AAVS1位點(diǎn)。

圖1 EGFP敲入方案設(shè)計(jì)

       經(jīng)過(guò)PCR和測(cè)序鑒定，確定獲得在AAVS1位點(diǎn)敲入EGFP的純合iPSC細(xì)胞系，熒光顯微鏡下觀察到EGFP 100%表達(dá)。細(xì)胞培養(yǎng)后經(jīng)G顯帶進(jìn)行染色體核型分析，顯示染色體數(shù)為46數(shù)目正常，染色體結(jié)構(gòu)無(wú)明顯異常。通過(guò)免疫熒光染色檢測(cè)NANOG、OCT4和SOX2三個(gè)干性標(biāo)記基因，均能檢測(cè)出陽(yáng)性信號(hào)，表明該敲入細(xì)胞具有干性。

圖2 iPSC-EGFP KI瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果
注：引物設(shè)計(jì)策略為擴(kuò)增整個(gè)EGFP及其所在基因組上下游的部分序列。無(wú)插入EGFP的帶型為762bp，成功插入EGFP的帶型為3194bp處。結(jié)果顯示，4個(gè)單克隆在3194bp處出現(xiàn)條帶，說(shuō)明克隆成功插入EGFP，且為純合克隆。

圖3 iPSC-EGFP KI測(cè)序結(jié)果

圖4 iPSC-EGFP KI純合克隆熒光圖片（EGFP在iPSC純合克隆中100%表達(dá)）

圖5 iPSC-EGFP KI核型分析（細(xì)胞培養(yǎng)后經(jīng)G顯帶進(jìn)行染色體核型分析，顯示染色體數(shù)為46數(shù)目正常，染色體結(jié)構(gòu)無(wú)明顯異常）

圖6 iPSC-EGFP免疫熒光-干性檢測(cè)（通過(guò)免疫熒光染色，檢測(cè)NANOG、OCT4和SOX2三個(gè)干性標(biāo)記基因，均能檢測(cè)出陽(yáng)性信號(hào)，表明該敲入細(xì)胞具有干性）

03 iPSC定向分化

定向分化即將iPSC通過(guò)特定的實(shí)驗(yàn)條件和細(xì)胞培養(yǎng)體系引導(dǎo)轉(zhuǎn)化為目標(biāo)類型的體細(xì)胞，如神經(jīng)元、心肌細(xì)胞、肝細(xì)胞等，賽業(yè)生物能提供多種疾病模型構(gòu)建及藥物篩選平臺(tái)，為廣大研究人員提供優(yōu)質(zhì)的個(gè)性化定制服務(wù)。

神經(jīng)干細(xì)胞（NPC）分化——神經(jīng)疾病及藥物模型

運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元（MN）分化——ALS等神經(jīng)疾病及藥物模型

造血干細(xì)胞（CD34+）分化——可用于血液譜系細(xì)胞分化如NK、T細(xì)胞等