慢病毒（Lentivirus，LV）作為一種優秀的病毒載體，被成熟運用于細胞免疫治療中，尤其是在Car-T療法中的廣泛運用，為腫瘤和免疫疾病的治療帶來了新的方向。

慢病毒來源于人免疫缺陷病毒，是逆轉錄病毒的一種。它通過將外源基因整合到宿主基因序列中，可以實現外源基因的穩定表達。目前使用的慢病毒經過科學家對膜蛋白的改造、去除復制相關基因和毒性基因等操作，獲得較高的安全性和廣泛的宿主感染能力，同時具有本身裝載容量大、可實現穩定外源基因表達的特點。

慢病毒的結構和特性使其在基因治療中具有獨特優勢，但同時也對生產和純化提出了挑戰：

• 單鏈RNA病毒

• 細胞裂解型

• 直徑80~120nm

• 裝載容量：最大9kb左右

• 包膜結構：對低pH、高溫、剪切力及鹽濃度敏感

目前，慢病毒的生產通常通過質粒轉染HEK 293細胞進行貼壁/懸浮培養，其工藝流程包括以下幾個步驟：HEK293細胞培養、澄清、核酸酶處理、超濾濃縮、層析純化、超濾換液和除菌過濾。

Fig.1 慢病毒生產工藝流程

慢病毒的活性需要依靠完整的包膜結構，但其包膜上的某些糖蛋白對高溫、剪切力、鹽濃度都敏感，包膜容易受到破壞導致病毒失活。

因此，在生產過程中要注意條件控制，例如超濾環節可采用300~750KD中空纖維柱，有效降低剪切力和壓力，控制剪切力＜4000/s-1，TMP為3~7psi，濃縮5~10倍。在層析步驟，要注意減少慢病毒與高鹽條件的接觸時間，適當添加穩定劑。慢病毒體積較大，采用0.22μm濾器進行除菌過濾收率一般只有60%~70%，為提高收率，生產過程可采用無菌生產工藝。對于工藝過程中慢病毒的回收率，需要重點考察感染滴度回收率，可采用QPCR或FACS法檢測感染滴度。

在層析純化之前，慢病毒通常經過核酸酶處理和過濾去除部分雜質。然而，HCP（宿主細胞蛋白）、HCD（宿主細胞DNA）等殘留雜質仍需通過層析純化進一步去除。根據慢病毒顆粒與雜質的大小和等電點差異，推薦使用復合模式和陰離子交換等填料進行純化。

Fig.2 博格隆復合模式填料（上）與陰離子交換填料（下）產品

博格隆Diamond Layer 700 是一款專為病毒和大分子純化設計的復合模式填料。其獨特的雙層結構使得大分子病毒不進入孔隙，直接流過柱床，而大部分雜質則通過離子和疏水相互作用被吸附在微球內部的配基上。該填料具有操作靈活性極佳、上樣量大、流速高的特點，與傳統的4FF、6FF分子篩相比，效率更高。

• 應用案例：采用Diamond Layer 700純化慢病毒，通常上樣量為0.3~6 CV，病毒感染收率可達60%以上。在上游雜質較少的情況下，一步純化即可滿足質量要求。

博格隆Diamond Q Mustang 和 Diamond DEAE Mustang 是兩種高分辨率的陰離子交換填料，可以用于進一步去除HCP、HCD、內毒素等雜質。雖然Q型強陰離子填料的載量高于DEAE弱陰離子填料，但因為Q填料配基的完全季氨基化，純化過程中會對慢病毒包膜結構造成影響，其感染回收率遠低于DEAE填料。因此，選擇適合的陰離子填料不僅能確保產品質量，還要根據病毒的特點合理調整工藝條件。

值得注意的是，慢病毒對高鹽敏感，陰離子交換純化過程中常用的NaCl 500mM以上洗脫后需迅速稀釋至200mM以下，避免對病毒結構的破壞。慢病毒在1M NaCl接觸1小時后，其感染活性會損失50%左右。同時，建議在整個純化過程中添加5%蔗糖作為穩定劑，進一步保護病毒的活性。

結語

慢病毒的高效純化是確保基因治療和細胞治療成功的關鍵。通過合理選擇層析介質并優化工藝參數，可以顯著提高慢病毒的回收率和純度。無論是Diamond Layer 700復合模式填料還是Diamond Q/DEAE Mustang陰離子交換填料，均提供了高效的解決方案，助力高質量的慢病毒生產。