引言

在細(xì)胞基質(zhì)流感疫苗應(yīng)用領(lǐng)域，MDCK細(xì)胞是最常用的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系之一^[1]。由于貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)工藝難以放大至商業(yè)化規(guī)模，并且使用載體會(huì)額外增加成本，因此對(duì)貼壁細(xì)胞進(jìn)行懸浮馴化及懸浮后的工藝開發(fā)目前已經(jīng)成為熱點(diǎn)^[2]。本文主要通過迪必爾生物 Opti-Cell mini（3L）生物反應(yīng)器建立MDCK細(xì)胞無血清全懸浮培養(yǎng)工藝，為流感疫苗的高效及低成本生產(chǎn)提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

研究路線

使用迪必爾生物 Opti-Cell mini（3L）生物反應(yīng)器（圖1）進(jìn)行MDCK細(xì)胞的培養(yǎng)。在初始1 L工作體積下，MDCK細(xì)胞接種密度為5.23×10⁵ cells/mL，本次實(shí)驗(yàn)工藝參數(shù)設(shè)置如表1所示。DO由氧氣的通氣速率級(jí)聯(lián)控制，空氣恒通0.008 vvm（8 mL/min）。當(dāng)原體系的pH值自然降低到設(shè)定值時(shí)開啟pH自動(dòng)控制，由二氧化碳的通氣速率和堿液（0.5M NaOH）的流加速率級(jí)聯(lián)控制。其中，進(jìn)氣模式均為底部通氣。在整個(gè)培養(yǎng)周期中，各參數(shù)控制均可靠且穩(wěn)定（圖2）。
 

圖2  培養(yǎng)過程中溫度、DO、pH參數(shù)變化曲線

Day 0~Day 5細(xì)胞密度變化如圖3所示，最高活細(xì)胞密度（VCD）為4.86×10⁶ cells/mL。葡萄糖和乳酸濃度變化如圖4所示，每24 h葡萄糖消耗量和乳酸積累量變化如圖5所示。隨著細(xì)胞的生長增殖，代謝產(chǎn)生大量乳酸，為維持pH值的恒定流加了大量堿液，導(dǎo)致體系滲透壓偏高，這也是后期細(xì)胞活率降低的原因之一。由于MDCK懸浮細(xì)胞株為貼壁細(xì)胞株經(jīng)懸浮馴化而來，懸浮培養(yǎng)條件下仍會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞黏附聚團(tuán)現(xiàn)象。由每天取樣鏡檢圖像（圖6）可見，從Day 2開始出現(xiàn)明顯細(xì)胞結(jié)團(tuán)現(xiàn)象，且后期細(xì)胞團(tuán)塊直徑逐漸變大，這與細(xì)胞活率降低也有一定關(guān)系，提示需要加入抗結(jié)團(tuán)劑保證單個(gè)細(xì)胞的均勻懸浮分散。本批次實(shí)驗(yàn)主要目的為驗(yàn)證3L反應(yīng)器控制性能及穩(wěn)定性，后期經(jīng)工藝優(yōu)化后細(xì)胞密度仍有提升空間。
 

圖3 細(xì)胞密度變化曲線

圖4 葡萄糖和乳酸濃度變化曲線

圖5 每24 h葡萄糖消耗量和乳酸積累量變化曲線

圖6 每24h取樣鏡檢圖

結(jié)論

針對(duì)細(xì)胞基質(zhì)流感疫苗的研發(fā)與生產(chǎn)，無血清全懸浮培養(yǎng)工藝的開發(fā)已成為研究重點(diǎn)。迪必爾生物 Opti-Cell mini生物反應(yīng)器（圖7）應(yīng)用靈活，適用于各種貼壁及懸浮哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)工藝的開發(fā)與優(yōu)化，支持批次、補(bǔ)料、灌流等多種培養(yǎng)工藝，搭載D²MS實(shí)現(xiàn)參數(shù)穩(wěn)定控制及高擴(kuò)展性應(yīng)用，助力生物制品的工藝驗(yàn)證與放大。
 

圖7 迪必爾生物Opti-Cell mini生物反應(yīng)器

參考文獻(xiàn)

[1] V. Lohr, Y. Genzel, I. Behrendt, K. Scharfenberg, U. Reichl, A new MDCK suspension line cultivated in a fully defined medium in stirred-tank and wave bioreactor. Vaccine. 2010, 28(38): 6256-6264.

[2] Wu, Y., Bissinger, T., Genzel, Y. et al. High cell density perfusion process for high yield of influenza A virus production using MDCK suspension cells. Applied Microbiology and Biotechnology. 2021, 105, 1421–1434.

應(yīng)用技術(shù)與工程研究中心CARE 張君軒 供稿