如何提升CY5/CY5.5熒光成像效果之濾光片篇
 

一、cy5/5.5光譜特征圖

花氰染料cy5/cy5.5常用于生物分子標(biāo)記，在熒光顯微成像、流式細(xì)胞儀分析、小動物活體標(biāo)記成像中均有廣泛使用。Cy5最大激發(fā)波長一般在649nm，最大發(fā)射波長一般在670nm；cy5.5最大激發(fā)波長一般在673nm，最大發(fā)射波長一般在695nm。其激發(fā)特征在近紅外（紅外）譜段，且激發(fā)和發(fā)射波長半高寬（特征譜線中峰值一半對應(yīng)的波長寬度）較窄，對濾光片組的選擇要求較高，否則熒光信號較弱或無法捕獲熒光信號。
 

左cy5光譜特征圖，右cy5.5光譜特征圖

二、Cy5/cy5.5熒光成像中的濾光片選擇

熒光成像基于斯托克斯位移原理，其基本表現(xiàn)為熒光物質(zhì)經(jīng)過特定波長的光激發(fā)，發(fā)射出較長波長的光。其激發(fā)和發(fā)射過程對應(yīng)到熒光顯微成像系統(tǒng)中的兩個關(guān)鍵部件分別是熒光光源和熒光激發(fā)塊，Cy5/cy5.5的熒光成像原理也是如此，只是其激發(fā)和發(fā)射特征偏向于近紅外（紅外），對于濾光片的選擇需更加注意。

Stokes位移，能級躍遷產(chǎn)生熒光信號
 

發(fā)射光譜比激發(fā)光譜波長更長
 

cy5/cy5.5熒光成像的核心部件：熒光激發(fā)塊。由三片濾光片組成：激發(fā)濾光片、二向分光鏡、發(fā)射濾光片。激發(fā)濾光片允許特定波長的光通過；二向分光鏡反射短波長的光，透過長波長的光；發(fā)射濾光片，只透過所要觀察波長的光，把不需要的波長的光去除。
 

激發(fā)塊示意圖，由三組濾光片組成
 

熒光濾光片主要有三種，LP長通濾光片，限定波長長于指定值的光可以通過；SP短通濾光片，限定波長短于指定值的光可以通過；BP帶通濾光片，可以讓中心波長附近一定波長的光通過，當(dāng)這個范圍比較窄的時候，我們還會給這種帶通濾光片“窄帶濾光片”的稱呼。
 

濾光片的三種類型：長通（LP）、短通（SP）、帶通（BP）
 

使用帶通濾光片可以獲得相對更高信噪比的熒光成像，而不同參數(shù)的帶通濾光片，會對成像效果有重大影響，比如下圖A和B兩組帶通濾光片，A組濾光片是窄帶，搭配比B組能多檢測出90%的有用信號，減少200%的背景干擾信號，在圖像上表現(xiàn)為A組信號更清晰透亮。此外，由于技術(shù)水平問題，國內(nèi)窄帶濾光片的截止深度（OD）要比進(jìn)口差，光譜表現(xiàn)為光通效率到邊緣“緩坡下降”而不是“斷崖下降”，最終成像效果不如進(jìn)口窄帶，單要稍優(yōu)于普通帶通。
 

窄帶濾光片成像更高信噪比
 

熒光信號的獲取在于激發(fā)光和發(fā)射光的選擇，激發(fā)濾光片需匹配光源中心波段與染料激發(fā)譜段，發(fā)射濾光片需覆蓋染料發(fā)射譜段峰值。以下是cy5、cy5.5兩個典型chroma公司濾光片組光譜圖。
 

Chroma CY5濾光片組EX:620/60，DM:660，EM:700/75
 

Chroma CY5.5濾光片組EX:650/45，DM:685，EM:720/60

三、明美濾光片選擇

濾光片的選擇應(yīng)根據(jù)實(shí)際的應(yīng)用、成本來綜合考量，進(jìn)口大截止深度、小窄帶寬度的濾光片有更好的效果，但成本也是顯著更高的，某些僅能適用cy5/cy5.5幾種染料，某些適用范圍更廣，所對應(yīng)的效果和成本也會有所變化，同時有的還考慮到與現(xiàn)有的光源、顯微鏡適配，選擇也會存在差異化。針對cy5/cy5.5等熒光染料，明美可提供國內(nèi)和國外不同廠家不同品質(zhì)型號的濾光片組，適用于奧林巴斯BX2或BX3系列、尼康Te/Ti系列、尼康50i/80i/90i、徠卡DM2500/3000/4000/5000/6000、蔡司Axio Imager等四大品牌多種信號，保證您的實(shí)驗效果，歡迎來電咨詢！
 

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