Vero細胞是生物醫藥領域中制備病毒載體和疫苗最常用的細胞系，基于微載體的灌流培養工藝是較為常用的生產方式，對較高微載體投放濃度條件下灌流工藝的建立必不可缺。

本文主要利用高密度微載體灌流工具在較小體積的CloudReady™云平臺生物反應器上進行Vero細胞高密度灌流培養及消化轉移工藝的探索，建立縮小模型。

方法與結果

使用CloudReady™（500 mL）云平臺生物反應器（圖1）和自行設計的灌流裝置完成Vero細胞在Cytodex 1 微載體上的高密度灌流培養。

攪拌槳葉使用多葉槳（低剪切力），攪拌方向為上揚式。

灌流工具安裝于反應器內部，通過管路與外部進、出液瓶連接。

圖1  CloudReady™云平臺生物反應器

實驗工藝參數設置如表1所示。

溫度由半導體Peltier模塊的加熱和制冷實現無水控溫。

DO由空氣和氧氣的通氣速率級聯控制。

pH由二氧化碳的通氣速率和堿液（0.5 M NaOH）的流加速率級聯控制。其中，進氣模式均為底部通氣。在完整的培養周期中，各參數控制均可靠且穩定（圖2）。
 

圖2  培養過程中溫度、pH、DO參數控制穩定性

Day 3時開始以2VVD的灌流速度進行灌流，在Day 8即灌流培養5天后細胞密度達到7.82×10⁶cells/mL，微載體上細胞密度變化如圖3所示。
 

圖3 微載體上細胞密度變化曲線

由每天取樣鏡檢圖像（圖4）可見，Day 1-2時細胞在微載體上貼附較為均勻，Day 3-5細胞快速增殖鋪板滿微載體表面，空球率低，Day 6-8細胞在微載體上生長至較滿的狀態。整個培養過程中灌流裝置未出現堵塞現象，細胞增殖13倍。

在培養結束時，使用胰蛋白酶-EDTA (0.25%) 進行消化，細胞收率64%，活率100%，將收獲所得細胞重新接種到原微載體上進行批次培養，細胞貼壁及增殖性能正常（圖4）。
 

圖4 每24 h及消化轉移取樣鏡檢圖

本實驗證實了該高密度灌流培養及逐級消化轉移工藝可行性較高，為后續更高微載體投放密度及逐級放大工藝的建立提供了縮小模型的數據基礎，也為實際規模化生產過程中種子細胞的批量制備提供了可嘗試的方法。
 

圖5  CloudReady™云平臺生物反應器

CloudReady™云平臺生物反應器（圖5）應用靈活，可實現各類貼壁或懸浮細胞高密度培養，進行批次、補料、灌流等多種生物工藝的開發和優化，在較小體系中迅速建立工藝流程，助力研發效率飛速提升。