質(zhì)膜蛋白和細(xì)胞組分分離試劑盒使用說明書
質(zhì)膜蛋白和細(xì)胞組分分離試劑盒
目錄號：SM-005
描述：
質(zhì)膜和細(xì)胞組分分離提取試劑盒利用離心管柱技術(shù)可以分離出天然的膜組分，其原理是細(xì)胞/組織通過 Buffer A 致敏，然后細(xì)胞以 Z 字形路徑通過離心管柱，在這個過程中細(xì)胞膜會破裂，分離出完整的核,因此最終獲得的膜組分中不含有核膜和核蛋白污染。通過差速離心和密度離心（無需超速離心）把細(xì)胞分為：細(xì)胞核，細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞器及質(zhì)膜。細(xì)胞高速離心通過具有 Z 字形通路的離心管柱時細(xì)胞膜會破裂，所以本試劑盒無需勻漿。勻漿在分離細(xì)胞膜實驗中的主要問題是每次勻漿的過程中蛋白質(zhì)圖譜都會發(fā)生變化，因此導(dǎo)致最終質(zhì)膜的純度有顯著變化（實驗間差異）。相比而言，我們的試劑盒只要每次實驗使用同樣起始樣品量，設(shè)定固定的離心力和離心時間，即可獲得一致性更好的結(jié)果。整個操作過程在 45 分鐘內(nèi)可以完成。
應(yīng)用：
本試劑盒可以從細(xì)胞或者組織樣品中快速分離天然膜組分，可應(yīng)用于 SDS-PAGE，immunoblottings，ELISA，IP，膜蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析，2-D，酶活性測定及其他應(yīng)用。
試劑盒組份：
1. 25 ml 裂解液 A
2. 10 ml 裂解液 B
3. 50 個離心管柱
4. 50 個收集管
5. 2 根塑料研磨棒
6. 組織分離粉
儲存：
-20℃儲存
所需附加材料
1XPBS
渦旋震蕩儀
臺式離心機(jī)
重要產(chǎn)品信息
1. 仔細(xì)閱讀整個操作說明。將緩沖液 A 和緩沖液 B 完全解凍后搖勻，放置于冰上。將離心管柱和接收管套管放置于冰上預(yù)冷。
2. 離心機(jī)請調(diào)整成 RCF/xg 模式，按照離心力設(shè)置離心機(jī)，所有離心步驟都需要在 4℃室溫下或者低溫離心機(jī)中進(jìn)行。
3. 研究蛋白磷酸化，磷酸酶抑制劑應(yīng)在使用前加入緩沖液 A 中。蛋白酶抑制劑可以選擇添加或不添加，如添加在使用前加入緩沖液 A 中（請按照蛋白酶或磷酸酶抑制劑母液比例，例如母液是 100x，添加時按照 1：100 添加，1ml 緩沖液 A 添加 10ul 抑制劑）。
4. 推薦使用 BCA 方法測定蛋白濃度。
5. 研磨方式請按說明書操作，請勿使用液氮研磨。
膜組分分離步驟
A.總膜組分分離
1. 將離心管柱及接收管套管放置冰上預(yù)冷
2. 細(xì)胞樣品，低速離心（500-600Xg，5 分鐘）收集 1-50 x106 個細(xì)胞。接轉(zhuǎn) 3a 步驟。組織樣品，接轉(zhuǎn) 3b 步驟。（貼壁細(xì)胞樣品建議使用細(xì)胞刮刀收集，盡量不使用胰酶消化）
注意：從細(xì)胞樣品中分離質(zhì)膜組分，建議細(xì)胞量為 20-50 X 106 個細(xì)胞。
3a. 用預(yù)冷的 PBS 清洗一次細(xì)胞。去除上清，在 Buffer A 中重懸細(xì)胞（起始細(xì)胞數(shù)小于 5X 106 加入 200ul Buffer A，起始細(xì)胞數(shù)大于 5x106 加入 500ul Buffer A）。冰上孵育 5-10 分鐘。渦旋大力震蕩 10-30 秒。迅速將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入離心管柱中。接轉(zhuǎn)步驟 4.
3b. 組織樣品，將新鮮組織（10-30mg）或冷凍組織（20-30mg）放置于離心管柱上。加入 200ulBuffer A，用塑料棒反復(fù)扭轉(zhuǎn)研磨組織 1 分鐘（注意：如果你的樣品是骨骼或是心肌，建議在研磨前加入 100-200mg 組織分離粉）。再加入 300ul Buffer A，用吸頭吹打幾次后，開蓋冰上孵育 5 分鐘。接轉(zhuǎn)步驟 4.
注意：存在少量的非均質(zhì)組織不會影響樣品的質(zhì)量。塑料棒可重復(fù)使用。用 75%酒精擦拭或用蒸餾水沖洗干凈。
4.蓋上蓋子，16,000Xg，離心 30 秒。（此步驟推薦使用可在 10S 內(nèi)達(dá)到離心力的臺式離心機(jī)，離心機(jī)的離心力和升速時間會影響膜組分得率）
優(yōu)化：細(xì)胞樣品建議第 4 步完成后再次重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)移回離心管柱中，16,000Xg 再次離心 30 秒，重復(fù)此步驟可以增加 20-30%產(chǎn)量。
5.棄去離心管柱，渦旋大力震蕩 10 秒重懸細(xì)胞。
以下步驟將細(xì)胞分為四組分：細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞器和質(zhì)膜。
6.700Xg，離心 1 分鐘（沉淀是完整的細(xì)胞核）。將上清轉(zhuǎn)移到新的 1.5ml 離心管中，4℃，16000Xg離心 10-30 分鐘（延長離心時間可以增加產(chǎn)量），棄去上清（上清為胞漿組份），保存沉淀（沉淀為總膜組份包括細(xì)胞器和質(zhì)膜）。如果不需要分離質(zhì)膜做到此步驟即可，產(chǎn)量一般為 10-500ug/樣品。可將總膜組份存儲于-70℃或者根據(jù)下游實驗選擇溶解液溶解。如果需要提取質(zhì)膜，請不要冷凍總膜組份。分離質(zhì)膜繼續(xù)第 7 步驟。
B.質(zhì)膜組分分離
7. 加入 200ul Buffer B 用吸頭反復(fù)吹打或渦旋震蕩重懸總膜組份。4℃，7800Xg，離心 5 分鐘（注意：如果最終質(zhì)膜組份中含有細(xì)胞器膜污染，此步驟離心時間可增加到 20 分鐘提高純度，第一次使用建議按照說明書操作，無需調(diào)整離心時間）。沉淀部分為細(xì)胞器。
8.小心的將上清液轉(zhuǎn)移到新的 2.0ml 離心管中，加入 1.6ml 預(yù)冷的 PBS 混勻幾次(此步 1.6ml PBS用于調(diào)整溶液密度，不可減量)。16000Xg，離心 15-30 分鐘（延長離心時間可以增加產(chǎn)量）。棄去上清液，保存沉淀（沉淀為質(zhì)膜）。產(chǎn)量一般為 10-300ug/樣品。質(zhì)膜沉淀可以根據(jù)下游實驗需求用 20-200ul 含表面活劑的緩沖液溶解。推薦使用下表中 MinuteTM 系列溶解液溶解膜組分。做等電聚焦（2D 凝膠第一維）我們建議使用：7M 尿素/2M 硫脲/2%Chaps 和 20mM DTT (使用前將 DTT加入以上混合液中)。
推薦按照下游實驗應(yīng)用選擇以下蛋白溶解液溶解膜蛋白
產(chǎn)品名稱 貨號 下游實驗應(yīng)用
Minute™ 變性蛋白溶解液 WA-009 SDS-PAGE 電泳，WB，胰酶消化，用生物素標(biāo)記或組氨酸標(biāo)記純化蛋白質(zhì)等實驗
Minute™ 非變性蛋白溶解液 WA-010 ELISA，IP，CO-IP，酶活性檢測等其他應(yīng)用
Minute™ 質(zhì)譜專用蛋白溶解液 WA-011 胰酶消化及后續(xù)的質(zhì)譜分析
關(guān)于分離出的質(zhì)膜蛋白評價
許多研究人員利用 WB 對分離的膜蛋白進(jìn)行純度檢測。一些常用的“胞漿內(nèi)參”不僅僅存在于胞漿。例如 actin(1),GAPDH (2) 和 tubulin (3)主要存在于胞漿但是他們也存在于質(zhì)膜中。所以在某些細(xì)胞和組織的膜蛋白中可以檢測到這些內(nèi)參的弱信號不足為奇
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